Быстрая диссекция и диссоциация обонятельного эпителия мыши при одноядерных суспензиях
1 августа 2025 г.
В данной статье представлен упрощенный протокол диссекции и диссоциации обонятельного эпителия мыши с целью секвенирования одноядерной РНК.
Здесь мы предлагаем протокол, разработанный для помощи в быстром рассечении обонятельного эпителия с целью секвенирования одиночных или одноядерных клеток. В отличие от предыдущих методов, наш протокол отдает приоритет скорости и простоте обучения, и он идеально подходит для применения с одиночными клетками, где ткань гомогенизирована, и быстрая диссекция важнее, чем сохранение анатомической целостности. Наш протокол обеспечивает быстрое и удобное для пользователя препарирование обонятельного эпителия, что облегчает исследования секвенирования одиночных клеток и способствует исследованию генетической основы обонятельной системы.
Для начала получите голову мыши, с которой сняли кожу. С помощью тонких ножниц с острым концом сделайте два разреза, чтобы разорвать скуловые дуги от чешуйчатой кости двусторонне, поместив один кончик ножниц в заднюю орбиту, а другой примыкающий к слуховому проходу. Сделайте неглубокий разрез от орбиты к орбите вдоль самой передней стороны лобной кости, надрезая только тыльную поверхность лобной кости на глубину примерно один-два миллиметра.
Теперь разрежьте по средней линии черепа от большого затылочного отверстия через сагиттальный и межлобный швы, пока не дойдете до сделанного ранее межглазничного разреза. Вставьте пару щипцов в разрез по средней линии и сильно потяните одно полушарие свода черепа в сторону. Удерживая носовую кость и резцовые зубы, с помощью щипцов отламывайте контралатеральный свод черепа.
Позвольте мозгу, включая обонятельные луковицы, быть удаленными, а также оторванному полушарию кости. Затем с помощью кусачек для костей или ронжеров удалите оставшуюся лобную кость и предчелюстную кость до основания резцовых зубов. Разрежьте вдоль лобно-назального шва костными кусачками, чтобы освободить носовую кость от крибриформной пластины.
Затем с помощью щипцов приподнять носовую кость от крибриформной пластины, чтобы обнажить обонятельный эпителий. Если остаточная премаксиллярная кость препятствует дорсальному обонятельному эпителию, удалите его, прежде чем продолжить. Теперь с помощью щипцов с тонкими наконечниками аккуратно закрепите тыльную сторону носовой перегородки в месте ее соединения с крибриформной пластиной и потяните ее кзади.
Основной обонятельный эпителий вырвется на свободу в виде полностью неповрежденной структуры. Визуализационная проточная цитометрия показала, что 53,69% всех событий были ядрами. Среди одиночных ядер 53,89% имели высокую круговость.
Графики контроля качества подтвердили стабильное качество секвенирования по четырем образцам с равномерным распределением генов и митохондриального количества. Маркерные гены набора данных согласуются со многими хорошо известными маркерными генами для каждого типа клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол экспресс-диссекции и диссоциирования обонятельного эпителия мыши, предназначенный для облегчения проведения секвенирования РНК отдельных ядер. Метод ориентирован на скорость и простоту выполнения, что делает его подходящим для приложений, где необходима гомогенизация ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Геномика
- Исследования обонятельной системы
Теоретические сведения
- Секвенирование РНК единичных клеток и единичных ядер имеет решающее значение для понимания клеточного разнообразия.
- Предыдущие методы препарирования были направлены на сохранение анатомической целостности, что может быть неоптимальным для определенных целей.
- Обонятельный эпителий играет фундаментальную роль в трансдукции обонятельных сенсорных сигналов.
- Совершенствование методов препарирования может повысить эффективность генетических исследований, связанных с обонянием.
Цель исследования
- Предоставление удобного протокола выделения обонятельного эпителия.
- Обеспечение быстрой обработки тканей для исследований с помощью секвенирования единичных клеток.
- Стимулирование исследований генетических механизмов обонятельной системы.
Используемые методы
- Метод предполагает препарирование обонятельного эпителия мышиных моделей.
- Данная биологическая модель включает обонятельную систему мыши, что обуславливает необходимость быстрого извлечения тканей.
- Удаление костных структур и осторожное манипулирование обеспечивают сохранность основного обонятельного эпителия.
- Ключевые этапы включают проведение разрезов свода черепа и извлечение обонятельных структур.
- Для поддержания стабильного качества секвенирования был внедрен контроль качества.
Основные результаты
- Более половины собранных событий были идентифицированы как ядра, что свидетельствует об успешной изоляции.
- Высокая круглость ядер указывает на качественное сохранение структуры в процессе диссекции.
- Контроль качества продемонстрировал равномерное распределение ядерных и митохондриальных генов.
- Маркерные гены соответствовали установленным эталонам для данных типов клеток.
Выводы
- В исследовании представлен усовершенствованный экспресс-метод препарирования обонятельного эпителия.
- Обеспечивая эффективное секвенирование отдельных ядер, данный метод способствует пониманию генетических факторов обоняния.
- Этот протокол может расширить возможности анализа нейронных механизмов и пластичности в сенсорных системах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Быстрая и воспроизводимая подготовка суспензий одиночных ядер из обонятельного эпителия мыши позволяет проводить высокоразрешающее молекулярное профилирование различных популяций нейронов и клеток-предшественников. Данный протокол устраняет основное узкое место в геномике одиночных клеток за счет минимизации времени извлечения тканей и сохранения целостности ядер, что способствует надежной валидации мишеней и снижению механистических рисков в исследовательских конвейерах сенсорной нейробиологии. Этот подход повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и трансляционных исследований, сосредоточенных на генетических основах функции и регенерации обоняния.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность быстрого тестирования гипотез об экспрессии генов в обонятельных сенсорных нейронах и клетках-предшественниках.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения качества ядер для последующего секвенирования.
- Способствует механистическому снижению рисков при изучении путей-кандидатов, участвующих в обновлении сенсорных нейронов.
- Повышает прогностическую достоверность при приоритизации мишеней в исследованиях сенсорной системы.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высококачественных суспензий одиночных ядер, подходящих для стандартизированных рабочих процессов секвенирования единичных клеток.
- Гарантирует воспроизводимость и масштабируемость при работе с несколькими образцами и сериями экспериментов.
- Предоставляет количественные данные, включая выход ядер и показатели качества, для бенчмаркинга анализа.
- Позволяет достоверно оценивать изменения экспрессии генов в ответ на экспериментальные воздействия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям заболеваний для изучения дисфункции и регенерации обоняния.
- Обеспечивает преемственность от геномики на стадии открытия до доклинической валидации молекулярных мишеней.
- Снижает биологические риски, предоставляя стабильные и высококачественные данные для идентификации трансляционных биомаркеров.
- Способствует принятию взвешенных с учетом рисков решений о развитии портфелей в области сенсорной нейробиологии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол объединяет этапы раннего поиска и идентификации ведущих соединений, обеспечивая плавный переход от выделения тканей к секвенированию единичных ядер и последующему анализу данных.
- Фундаментальная биология: ускоряет проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в исследованиях обонятельной системы.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу ядерных суспензий с подтвержденными показателями качества.
- Аналитика: предоставляет количественные данные для сравнения экспрессии генов в различных типах клеток и условиях.
- Трансляционные исследования: способствует поиску биомаркеров и разработке доклинических моделей обонятельных расстройств.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный, воспроизводимый рабочий процесс подготовки единичных ядер из сенсорных тканей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность при проведении геномного анализа единичных клеток.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективно управлять портфелем с точки зрения использования капитала.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ в области сенсорной нейробиологии.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт в области экспресс-диссекции и выделения ядер из сложных анатомических структур.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для обработки тканей и контроля качества (например, к потоковой цитометрии с визуализацией).
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов разными операторами и в разных исследованиях.
- Может потребоваться адаптация метода для использования с другими типами тканей или модельными системами с иными анатомическими особенностями.
- Экстракция, ориентированная на скорость, может ограничить применение метода в случаях, когда критически важна анатомическая целостность.
