Визуальный контроль in vivo трансплантированных дистальных эпителиальных клеток-предшественников эпителия легких при фиброзе легких с помощью магнитопорошковой томографии

В данном исследовании сосредоточено на интратрахеальном протоколе интубации как критически важном методе доставки для терапии лёгкими клетками, с целью оптимизации трансплантации клеток и неинвазивного отслеживания с помощью магнитно-частичной визуализации при лёгочном фиброзе. Наш протокол решает отсутствие неинвазивных методов для in vivo отслеживания клеточной терапии при фиброзе лёгких, сочетая внутритрахеальную изоляцию с магнитно-частичной визуализацией для мониторинга распределения клеток. Наш протокол обеспечивает точную локализованную доставку клеток через интратрахеальную установку и превосходное отслеживание с помощью магнитно-частичной визуализации, обеспечивая высокочувствительное изображение в реальном времени без фоновых шумов.

Для начала взвесьте 12-недельного самца мыши с NOD или SCID, чтобы рассчитать необходимую дозу блеомицина. Приготовьте раствор блеомицина в стерильном физиологическом растворе в желаемой концентрации до 50 микролитров в микроцентрифуге объёмом 1,7 миллилитра. Затем загрузите раствор в пипетку.

Предварительно заполните шприц 200 микролитрами воздуха, чтобы весь объём жидкости был выведен в трахею во время инъекции. После анестезии мыши соберите комплект для интубации с помощью светового волокна с оптоволоконным зондом, продельным через ларингоскоп и катетер. Щипните палец животного, чтобы убедиться в достаточном наркозе, и наносите офтальмологическую мазь на оба глаза при анестезии.

Подвесьте мышь за резцы в положении на спине на наклонной стойке для интубации грызунов. С помощью тупых щипцев возьмите язык и аккуратно двигайте его вверх и влево, чтобы открыть гортань для чёткого визуализации. Включите волоконно-оптический зонд и направьте его в рот, чтобы приблизиться к трахее.

Используйте увеличитель ларингоскопа для улучшения видимости и идентификации голосовых связок в отверстии трахеи. Введите катетер в отверстие трахеи и аккуратно вынимите ларингоскоп. Затем каплю физиологического раствора объёмом 20 микролитров на верхний конец катетера.

Подключите шприц, заранее заполненный 200 микролитрами воздуха, и введите каплю в трахею. Затем загрузите катетер до 50 микролитров блеомицина и введите его с помощью шприца, наполненного воздухом. Держите катетер на месте 5-7 секунд, чтобы предотвратить обратный поток жидкости из трахеи.

Затем аккуратно снимите катетер. Держите мышь на подставке для интубации в одном положении не менее 30 секунд. Затем снимите мышь с подставки и поместите её в клетку для восстановления, установленную на грелке.

Следите за мышью непрерывно, пока она полностью не восстановится после наркоза. Получить наночастицы человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей у пациентов с идиопатическим лёгочным фиброзом. Через 72 часа после установки блеомицина повторно анестезируйте мышь и повторите процедуру интрахеальной установки, чтобы ввести 50 000 клеток в 50 микролитрах суспензии клеток.

Дайте мыши восстановиться не менее 20 минут перед магнитной изображенией. Установите подкладку мыши в магнитном сканере частиц после того, как пропустите анестезиологическую линию под столом через нужные разъёмы. Пока мышь анестезируется, подготовьте сканер магнитных частиц.

После подтверждения достаточной анестезии с помощью теста с защемлением пальца аккуратно разместите мышь на магнитно-частицевом снимке. Введите стол мышью в канал сканера и нажмите Start Scan в программном интерфейсе, чтобы запустить изображение. После завершения сканирования вынимите мышь с магнитного стола и поместите её в клетку для восстановления, установленную на грелке.

Наконец, проанализируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Интенсивность сигнала 2D-магнитных частиц (MPI) увеличивалась пропорционально концентрации трассера оксида железа во всех тестируемых клетках. Оптимальной для маркировки была выбрана концентрация 250 микрограмм на миллилитр.

Флуоресцентная микроскопия подтвердила успешное in vitro маркирование клеток, показав сигналы красного декстрана в цитоплазме и синих ядрах, окрашенных DAPI. Интенсивность сигнала на 2D-изображениях MPI увеличивалась с количеством размеченных клеток, что подтверждает положительную корреляцию между сигналом и количеством клеток. На основе этого было отобрано 50 000 клеток для трансплантации.

Изображение управления пустым столом не показывало фонового сигнала MPI, что подтверждало специфичность сканера к маркированным ячейкам. Четыре наблюдаемых сигнала соответствуют фидуциальным маркерам, используемым в качестве контрольных показателей. Успешная трансплантация меченых клеток в лёгкие дала отчетливый сигнал MPI в форме бабочки с видимым распределением в обоих лёгких, что подтвердило эффективную внутритрахеальную доставку.

Неполная установка клеток привела к появлению сигнала как в легких, так и в области шеи, что указывает на утечку из-за преждевременного удаления катетера. Неправильное размещение катетера в пищеводе вместо трахеи привело к появлению сигнала MPI ниже в брюшной полости, что указывает на отложение клеток в желудке. Через 14 дней после трансплантации экс-виво визуализация удаленных лёгких подтвердила сохранение меченых клеток.

Наши результаты повысят точность диагностики и позволят разрабатывать таргетные методы лечения заболеваний лёгких, включая терапию стволовыми клетками, ускоряя прогресс и инновации в области визуализации лёгких и смежных биомедицинских областей. Наша лаборатория сосредоточится на совершенствовании терапии на основе стволовых клеток для лечения фиброза лёгких, совершенствовании неинвазивных методов визуализации, а также оптимизации доставки клеток и мониторинга терапевтической эффективности при лёгочном фиброзе.