Эксплантная модель ex vivo для изучения глиальных взаимодействий в сетчатке мыши

Мы хотим понять нейровоспаление при глаукоме, ведущую причину необратимой слепоты во всем мире. В частности, мы изучаем, как глиальные вспомогательные клетки в сетчатке влияют на потерю нейронов во время прогрессирования заболевания.

Считается, что глии, такие как астроциты и микроглии, влияют на прогрессирование глаукомы, но многие инструменты, используемые для изучения функции нейронов в моделях живых животных, плохо подходят для этих клеток. Экспланты сетчатки используются для изучения нейровоспаления и глиальной функции, но кривая обучения крутая. Наш протокол делает его более доступным и, как мы надеемся, позволит более широко внедрить эту технику.

По сравнению с традиционной культурой клеток in vitro, наш подход к эксплантам лучше сохраняет естественную среду для клеток внутренней сетчатки, что позволяет более точно исследовать их физиологические функции.

[Рассказчик] Для начала поместите извлеченный мышиный глаз в чашку для вскрытия, наполненную стерильным PBS комнатной температуры. Определите подходящую точку удержания и возьмитесь за нее наклонными щипцами, затем аккуратно расположите глаз на погруженной лабораторной салфетке, убедившись, что передняя и задняя ось от роговицы до зрительного нерва расположена горизонтально. Крепко удерживая щипцами под углом, используйте кончик скальпеля No 11, чтобы сделать разрез параллельно и примерно на 0,5 миллиметра позади лимба, где роговица переходит в склеру. Вставьте одно лезвие пружинных ножниц внутрь глобуса и разрежьте вокруг глаза, при необходимости меняя положение щипцами. После завершения околочелюстного разреза удалите передний сегмент и хрусталик с помощью щипцов. Если остался длинный кусок зрительного нерва, обрежьте его до длины в один-два миллиметра с помощью тонких ножниц. Затем поверните наглазник так, чтобы он был направлен вверх, чтобы обеспечить визуальный осмотр и облегчить удаление стекловидного тела. Продолжайте использовать угловые щипцы для иммобилизации наглазника и осмотрите сетчатку на предмет видимых повреждений и осмотрите камеру стекловидного тела на наличие фрагментов пигментных клеток из пигментного эпителия сетчатки или сосудистой оболочки. С помощью модифицированного трансферного пипетки промойте стекловидное тело PBS, удерживая наконечник пипетки погруженным в воду, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Затем с помощью тонкой акварельной кисти аккуратно удалите более крупные загрязнения, сводя к минимуму контакт с сетчаткой. При стойком загрязнении осторожно используйте щипцы с тонкими наконечниками, избегая прямого контакта металла с сетчаткой. После удаления видимого мусора промойте стекловидное тело PBS из трансферной пипетки три-пять раз и с помощью тонкой щетки прощупайте вблизи периферии остаточные элементы цилиарного тела, обнаруживая стекловидное тело по волокну щетки. Если карманы стекловидного тела остались, проведите щеткой наружу по направлению к периферии, сохраняя волокна под небольшим углом, чтобы предотвратить повреждение сетчатки. Держите пару щипцов в закрытом положении так, чтобы кончики соприкасались, и осторожно вставьте их между сетчаткой и сосудистой оболочкой, используя любые естественные зазоры, образовавшиеся во время работы. Используйте плоские плечи щипцов, чтобы постепенно увеличивать пространство между сетчаткой и сосудистой оболочкой до полного разделения. Продолжайте стабилизировать образец с помощью одной пары щипцов, в то время как с помощью второй пары осторожно потяните наглазник, включая склеру и сосудистую оболочку, вниз. Если сетчатка опускается вместе с наглазником, используйте щипцы, чтобы осторожно прощупать и отсоединить все оставшиеся точки соединения, избегая головки зрительного нерва. Затем, когда сетчатка все еще закреплена на диске зрительного нерва, продолжайте удерживать ткань в устойчивом положении и используйте вторую пару щипцов, чтобы собрать наглазник ниже диска зрительного нерва. Осмотрите, чтобы убедиться, что периферия сетчатки не складчата из-за остаточного стекловидного тела, особенно в местах, где остается цилиарное тело. При необходимости промойте камеру PBS с помощью переводной пипетки и с помощью щетки аккуратно раскрутите складчатую сетчатку и удалите излишки стекловидного тела. После того, как сетчатка будет обнажена с обеих сторон, с помощью пружинных ножниц сделайте серию разрезов под углом примерно 90 градусов от периферии сетчатки по направлению к диску зрительного нерва. Удерживая погруженную ткань, с помощью щипцов оттяните лабораторную салфетку от образца и удалите ее из чашки, не касаясь сетчатки. Удерживая сетчатку на месте, с помощью пружинных ножниц перережьте зрительный нерв прямо под сетчаткой. Затем осторожно поднимите и снимите с посуды остатки салфетки наглазника. Теперь заполните 35-миллиметровую чашку Петри PBS и с помощью щипцов поместите фильтрующий квадрат на дно шероховатой матовой стороной вверх, избегая складок. Затем с помощью переводной пипетки аккуратно аспирируйте сетчатку и перенесите ее в чашку Петри. С помощью кисти сориентируйте сетчатку внутренней поверхностью вверх и расположите ее прямо над квадратом фильтра. Медленно аспирируйте PBS, чтобы опустить сетчатку на фильтр. После того, как сетчатка окажется на фильтре, с помощью щетки аккуратно разверните все периферические складки. Отрегулируйте уровень PBS, чтобы сбалансировать стабильность и увлажнение сетчатки, обеспечивая плавное движение щетки без пересушивания тканей. Теперь используйте переводную пипетку, чтобы капнуть PBS с высоты примерно одного сантиметра, чтобы промыть поверхность и снова осмотреть сетчатку на наличие мусора. Закройте крышку 35-миллиметровой посуды и отнесите ее в шкаф биобезопасности. Поместите закрытую тарелку внутрь шкафа биобезопасности, не соприкасаясь с внутренними поверхностями или оборудованием. Стерилизуйте или замените перчатки при переходе к асептической работе и перенесите шестилуночный планшет, предварительно загруженный эксплантной средой, из инкубатора в шкаф биобезопасности. Внутри шкафа снимите крышку 35-миллиметровой тарелки и с помощью угловых щипцов приподнимите квадрат фильтра, не касаясь сетчатки. Затем откройте шестилуночную пластину и аккуратно опустите фильтр на центр вкладыша в одну лунку, медленно погружая его в фильтрующий материал. Как только сетчатка отделится от фильтра, медленно отодвиньте фильтр в сторону и извлеките его из лунки с помощью угловых щипцов. С помощью пипетки объемом один миллилитр отсасывайте 500 микролитров среды из вкладыша, захватывая сетчатку между вкладышем и воздушно-жидкостным интерфейсом. Наконец, установите на место крышку шестилуночного планшета и верните его в инкубатор, убедившись, что сетчатка остается в центре лунки. Для изучения масштабных изменений в глии сетчатки трехдневные экспланты сравнивали с фиктивными эксплантациями, зафиксированными сразу после изоляции, а не культивировали. Микроглия в фиктивной сетчатке показала регулярный, неперекрывающийся характер распределения, в то время как к третьему дню организация эксплантированных сетчаток стала нерегулярной, а клетки стали появляться кластеризованными, что указывает на миграцию. Астроциты сетчатки в фиктивной сетчатке демонстрировали тесное выравнивание с сосудистой сетью, которое значительно уменьшилось после трех дней in vitro. Экспрессия GFAP в клетках Мюллера была слабой или отсутствовала в фиктивных сетчатках, но стала отчетливо заметной к третьему дню in vitro, особенно вблизи краев тканей. После одного дня in vitro микроглия продемонстрировала ретракцию процесса и ранние признаки активации, которые прогрессировали до компактной амебоидной морфологии к третьему дню. На 24-часовой отметке плотность ганглиозных клеток сетчатки, количественно определенная с помощью Brn3a, показала скромное, но заметное снижение количества культуральных эксплантов по сравнению с фиктивными. TMEM119, гомеостатический маркер микроглии, был высоко экспрессирован в фиктивной сетчатке, но был практически необнаруживаемым после трех дней in vitro. Экспрессия CD206, маркирующая гиалоциты, оставалась стабильной после трех дней культивирования in vitro. Окрашивание GFAP выявило реактивность астроцитов и клеток Мюллера вокруг участков механических повреждений, полученных во время вскрытия и обработки.