Маркировка ЭСК и hMSCs с Оксид железа наночастиц для неинвазивного в естественных условиях слежения с МРТ

Для оценки методов лечения, новых стволовых клеток важно неинвазивно трек вводили клетки в живом организме. Это видео покажет вам, как ярлык человека мезенхимальных и эмбриональных стволовых клеток с железом на основе оксида контрастных средств в естественных условиях для последующего МРТ в естественных условиях.

Добро пожаловать в лабораторию доктора Хайку Дал Линка. Мы хотели бы поблагодарить Калифорнийский институт регенеративной медицины за финансирование этого проекта по оценке новых методов лечения стволовыми клетками. Важно неинвазивно отслеживать введенные клетки in vivo.

Это возможно путем мечения клеток in vitro специфическими или многофункциональными контрастными веществами для МРТ или оптической визуализации. В этом видео показано, как пометить мезенхимальные и человеческие эмбриональные стволовые клетки для последующей визуализации in vivo. Здравствуйте, я Тобиас Хеннинг из исследовательской группы по контрастным веществам в Центре молекулярной и функциональной визуализации на факультете радиологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Сегодня я покажу вам процедуры мечения in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека периком, кароном и эмбриональных стволовых клеток человека оксидами фенов. Эта методика полезна для того, чтобы локализовать введенные клетки in vivo или получить информацию об их функциональном состоянии. Процедуры мечения клеток с помощью сознательного агента МРТ различаются для эмбриональных и мезенхимальных стволовых клеток, но оба метода включают в себя следующие этапы: подготовка клеточной культуры, то есть покрытие клеток в соответствии с клеточной культурой, подготовка мечения, мечение клеток в среде с помощью простой инкубации трипсином стволовых клеток и смывание свободного сознательного агента, оценка эффективности мечения и жизнеспособности клеток.

Итак, давайте начнем и пометим некоторые ячейки. Теперь давайте начнем с мечения мезенхимальных стволовых клеток с помощью Тео Карбаттрола. Во-первых, я покажу технику мечения мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью теокаррона и контрастного вещества на основе оксида железа для МРТ-томографии.

Для начала мы помещаем клетки в тарелки за 18-24 часа до процедуры мечения в колбах T 75 с конфлюенцией 80%. В противном случае, если вы используете другую культуральную чашку, равную примерно 10 000 клеток на квадратный сантиметр на следующий день, мы начинаем с подготовки носителя для маркировки, добавляя 30 микролитров rereserveist к восьми миллилитрам свободной сыворотки среды. Это позволит маркировать один T 75 FLA с сотекучестью 80% и соответствует концентрации в сто микрограммов железа на миллилитр среды. Теперь мы снимаем питательную среду и один раз промываем клетки PBS или средой без сыворотки.

Мы делаем это, чтобы избавиться от остаточных сывороточных белков и других составляющих среды, которые могут связывать контрастные вещества и влиять на эффективность мечения. Добавьте в колбу этикетировочный материал и поставьте колбу обратно в инкубатор. Через два часа добавьте два мл FCS, чтобы была достигнута конечная концентрация 20% FCS.

Мы делаем это для того, чтобы клетки не получали никаких стимулов для дифференцировки того, что они мертвы, растут в привычной для них среде. Теперь инкубируем клетки в течение 18 часов. На следующий день мы промываем клетки PBS, а затем проводим их бактериологическое исследование в соответствии со стандартными протоколами культивирования, чтобы избавиться от свободного контрастного вещества.

После введения трипса клеточную суспензию промывают три раза центрифугированием при 400 RCF в течение пяти минут, а затем суспензируют в PBS. Ну вот. Последняя клетка P может быть ресуспендирована и готова к дальнейшим экспериментам.

Теперь мы считаем ячейки, так как некоторые из них мы могли потерять во время предыдущих этапов промывки. На этом этапе мы также проводим тестирование жизнеспособности с помощью теста исключения синего триппина и отбираем несколько образцов для спектрометрического анализа для измерения эффективности мечения. Теперь позвольте мне показать вам, как маркировать человеческие эмбриональные стволовые клетки оксидами фенов.

Для начала мы помещаем человеческие эмбриональные стволовые клетки в 10-сантиметровые чашки. Как обычно, эти посуды предварительно закодированы желатином и имеют на них облученные питательные клетки. Вы также можете использовать этот протокол для культур без кормушки.

Мы позволяем человеческим эмбриональным стволовым клеткам прикрепляться и расти в течение примерно трех-четырех дней, чтобы они образовали колонии среднего размера. В течение этого времени мы следим за тем, чтобы колонии не разрастались слишком большими, потому что большие колонии сложнее разбить. Позже дифференцированные клетки могут загрязнять эти культуры.

Таким образом, в зависимости от чистоты колоний, нам, возможно, придется избавляться от дифференцированных культур путем вскрытия. Теперь мы готовим среду для мечения, которая состоит из теоремных оксидов в концентрации сто микрограмм железа на миллилитр и полной среды для эмбриональных стволовых клеток человека. Для этого смешиваем 89 микролитров, фемоксидов, и 10 миллилитров полной питательной среды.

Что касается мезенхимальных стволовых клеток, то мы промываем посуду один раз сплошным фильтром, чтобы избавиться от мертвых клеток или мусора. Затем добавляем по 10 миллилитров маркировочного материала на чашку и инкубируем клетки в течение четырех часов. Теперь маркировка завершена.

На следующем этапе нам нужно промыть клетки и получить одноклеточную суспензию. Для дальнейшего использования предварительно ополаскиваем посуду с помощью PBS. Теперь мы заменяем PBS пятью миллилитрами 0,25% трипсина и инкубируем в течение пяти минут в инкубаторе или до тех пор, пока клетки не отделятся.

Помогает частое постукивание по тарелке, ячейки теперь отсоединились. Имейте в виду, что если в блюде были большие колонии, это могут быть некоторые комки, чтобы избавиться от этих комков. Мы тщательно перемешиваем всю суспензию, пипетируя вверх и вниз с помощью серологической пипетки, а затем даем ей постоять еще две минуты.

В состав входит трипсин. Мы не используем пипетку Eppendorf, так как повторное пипетирование клеток через тонкий наконечник может нарушить клеточные мембраны, если все работало правильно. Теперь у нас есть суспензия одиночных клеток, которая смешана с большим количеством мусора, образующегося из желатина, покрывающего матрикс эмбриональных стволовых клеток и мертвые клетки.

Теперь мы можем избавиться от оставшихся скоплений или комплексов, пропуская клетки через клеточное сетчатое фильтр с толщиной 40 микрометров. Теперь нам нужно выделить эмбриональные стволовые клетки человека из облученных фидерных клеток. Это можно сделать эффективно, поместив клеточную суспензию на чашку, покрытую желатином.

Если мы не будем манипулировать чашкой, все клетки будут осаждаться, но кормушки будут прикрепляться быстрее, чем человеческие эмбриональные стволовые клетки. Таким образом, если мы снимем СУП через 45 минут, он должен содержать в основном человеческие эмбриональные стволовые клетки, в то время как кормушки в основном должны быть прикреплены к чашке. Таким образом, мы получаем одноклеточную суспензию магнитно меченых человеческих эмбриональных стволовых клеток, которую можно использовать для дальнейших экспериментов, как и в предыдущем протоколе.

На этом этапе нужно подсчитать клетки и взять образцы для оценки жизнеспособности и измерения эффективности мечения. На этом мы завершаем протоколы, которые я хотел показать вам сегодня. Теперь давайте рассмотрим, как мы можем отслеживать меченые стволовые клетки in vivo.

На этом слайде показаны меченые OC Carone стволовые клетки. После того, как они были введены в мозг мыши, мы восстановили 20 000 клеток в объеме 75 нанолитров и ввели их в субжелудочковую зону. Оксид железа в имплантированных клетках вызывает артефакт восприимчивости, который можно увидеть на МРТ. Изображения.

Мы только что показали вам, как маркировать эмбриональные и мезенхимальные стволовые клетки. Отслеживание мезенхимальных и эмбриональных стволовых клеток in vivo in vitro с помощью Mr.Contrast agents имеет огромный потенциал для оценки новых методов лечения стволовыми клетками. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в маркировке клеток.