Количественное определение виолацеина в Chromobacterium violaceum и его ингибирование биологически активными соединениями

Наше исследование направлено на выявление соединений, которые ингибируют чувство кворума, регулирующее ключевые фенотипы. Этот протокол проводит скрининг молекул, которые снижают выработку виолацина, не влияя на рост бактерий, что предполагает интерференцию чувства кворума. Недавние исследования выявили новые биологически активные соединения, которые подавляют чувство кворума, не влияя на рост бактерий, усиливая их потенциал в качестве антивирулентных агентов против устойчивых к антибиотикам бактерий.

Основные проблемы включают специфичность ингибирования чувства кворума, поскольку соединения могут влиять на рост или признаки. В этом протоколе, называемом уважением и растворимостью, уравновешиванием воздействия, количественной оценкой, требуется осторожное обращение. Мы разработали протокол, используемый в биоактивных соединениях в субингибиторных концентрациях, которые не влияют на рост бактерий.

Это ключевая предпосылка для начала чувствительной сигнализации кворума, отличной от исследований противомикробных препаратов. Мы сосредоточимся на выявлении новых ингибиторов состояния кворума и выяснении механизмов ингибирования коммуникации, особенно у бактерий, имеющих отношение к пище и здоровью. Для начала вырастите пятимиллилитровую культуру chromobacterium violaceum ATCC 12472 в бульоне Luria Bertani или LB.

Инкубируйте культуру при температуре 30 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе, установленном на 220 оборотах в минуту, в течение 24 часов. Измерьте оптическую плотность ночной культуры и отрегулируйте ее примерно до 10 в степени восьми колониеобразующих единиц на миллилитр. С помощью бульона LB.

Для приготовления компаунда взвесьте биологически активное соединение и разведите его либо в чистом ДМСО, либо в смеси ДМСО и воды один к одному, в зависимости от растворимости. Возьмите плоское дно 96 луночной пластины и добавьте бульон LB вместе с биологически активным соединением по схеме серийного разведения. Для расчета необходимого объема исходного раствора для нужной концентрации в каждой лунке применяют формулу.

В первом столбце каждого набора для разведения крупы. Добавьте 196 микролитров бульона Luria Bertani в третью, пятую и седьмую колонки. Затем в последующие колонки, используемые для разбавления, добавьте 100 микролитров бульона Luria Bertani в четвертую, шестую и восьмую колонки.

Чтобы начать серийное разведение, добавьте четыре микролитра биологически активного соединения в первую лунку каждого набора, что соответствует столбцам три, пять и семь. После перемешивания переложите по 100 микролитров из каждой лунки в соседнюю колонку. Продолжить серийное разведение, дойдя до четвертой, шестой и восьмой колонн.

Повторите всю процедуру в трех экземплярах для каждой концентрации каждого соединения, используя свежие наконечники, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Добавьте 80 микролитров бульона Luria Bertani в ряды от B до D во всех лунках. Доводим итог до 180 микролитров на лунку.

Затем добавьте по 20 микролитров стандартизированной культуры chromobacterium violaceum из предыдущего препарата в каждую из этих лунок, достигнув конечного объема 200 микролитров. Основано на совместимости спектрофотометра. Накройте микропланшет крышкой или герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение.

Инкубируйте герметичную пластину при температуре 30 градусов Цельсия с перемешиванием со скоростью 130 оборотов в минуту в течение 24 часов. После инкубации перенесите тарелку в сушильный инкубатор, установленный при температуре 60 градусов Цельсия. Снимите крышку и дайте ей полностью высохнуть в течение примерно восьми часов.

После высыхания достаньте тарелку из инкубатора и добавьте по 200 микролитров чистого ДМСО в каждую лунку. Накройте пластину крышкой и инкубируйте ее при температуре 25 градусов Цельсия с встряхиванием со скоростью 130 оборотов в минуту в течение 30 минут до растворения пигмента виолацеина. После инкубации осторожно переложите 100 микролитров растворенного раствора виоласеина в новую микропластину.

Избегайте контакта наконечника пипетки со стенками лунки. Измерьте поглощение виолацеина на 595 нанометрах в микропланшетном спектрофотометре с закрытой крышкой, чтобы избежать загрязнения. Встряхивайте в течение пяти секунд перед каждым чтением и выполняйте чтение с закрытой крышкой, чтобы избежать загрязнения.

Чтобы рассчитать выработку виолацеина, сначала вычтите поглощение заготовки из каждого образца, чтобы исключить фоновую интерференцию, а затем рассчитайте процент виолацеина, используя необработанный контроль в качестве эталона с уравнением. Три биологически активных соединения, ресвератрол, фарнезол и линалоол, были проверены на их способность ингибировать выработку виолацеина в chromobacterium violaceum ATCC 12472. Фарнезол значительно снижал выработку виолацина до 9% при 200 мкг на миллилитр и до 19% при 100 мкг на миллилитр, по сравнению со 100% в контрольной группе, не получавшей лечения.

Лечение линалоолом в дозе 200 и 100 мкг на миллилитр привело к выработке виолацина на уровне 32%, показав 68% ингибирование по сравнению с контролем. Ресвератрол в концентрации 25 мкг на миллилитр снижал выработку виолацеина до 15%, в то время как при концентрации 12 мкг на миллилитр достигал 30% по сравнению со 100% в контрольной группе, не получавшей лечения. Изображения с микропланшетов визуально подтвердили снижение пигментации виолацина при всех процедурах по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения.