In vitro Восстановление цитоскелетных сетей внутри разделенных по фазам гигантских униламеллярных везикул (ГУВ)

Наше исследование изучает, может ли минимальная синтетическая клетка воспроизводить ключевые биологические функции, уделяя особое внимание разработке мембран, которые точно имитируют структуру и поведение естественных клеточных мембран.

Для создания фазово-разделенных везикул используются различные технологии и эти микроносители для различных применений. К таким технологиям относятся, например, двухслойные cDICE и электроформовка. Одной из основных проблем является поддержание функциональности белка при создании фазового разделения на мембранном везикуле. Повышение температуры может дестабилизировать белки и другие биомолекулы.

[Рассказчик] Для начала приобретите флаконы с биотинилированными и небиотинилированными липидными смесями. Растворите по 50 микролитров каждой 32-миллимолярной липидной смеси в хлороформе. Затем высушите их в двух стеклянных флаконах под потоком газообразного азота в течение примерно 15 минут. Поместите стеклянные флаконы в эксикатор. Храните их под вакуумом примерно 30 минут, чтобы удалить остатки хлороформа. Теперь диспергируйте высушенные липидные пленки в смеси 20 микролитров декана и 500 микролитров минерального масла в тех же флаконах, чтобы достичь конечной концентрации липидов 3,2 миллимолара. Используя ультразвуковую терапию для ванны, обрабатывайте две смеси ультразвуком при температуре примерно 50 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем переложите липидную и масляную смеси в две пробирки. Пока смеси инкубируются, приготовьте внутреннюю инкапсуляционную смесь для белков. Чтобы приготовить белковую смесь FtsZ, добавьте перечисленные реагенты до конечного объема 10 микролитров в пробирку. Держите смесь на льду до использования. Для инкапсуляции пучков актина сначала приготовьте 10 микролитров смеси актина Master Mix, содержащей 86% G-актина, 10% актина ATTO 488 и 4% биотинилированного актина в воде. Держите смесь на льду и бейте ее от света. Непосредственно перед использованием приготовьте окончательный раствор актина, добавив по порядку йодиксанол, воду, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x актиновый полимеризационный буфер, A-Mix, фашин и АТФ. Хорошо перемешайте, и используйте пять микролитров для капсулирования. Чтобы инкапсулировать FtsZ, пипетку 500 микролитров реакционного буфера FtsZ в пластиковую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Аккуратно добавьте 200 микролитров липидно-масляной смеси, чтобы сформировать масляно-водную границу. Во второй тюбик добавьте 200 микролитров липидно-масляной смеси. Инкубируйте эту трубку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем нанесите пипеткой пять микролитров белковой смеси FtsZ в инкубированную липидно-масляную трубку, позволяя ей погрузиться в виде капли. Аккуратно постучите по тюбику пять-шесть раз, пока раствор не станет мутным, чтобы образовалась эмульсия. Осторожно пипетируйте эту эмульсию поверх подготовленной ранее масляно-водяной границы. Затем центрифугируйте образец при 6000 г в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Охладите образец до комнатной температуры в течение 30 минут. Теперь с помощью пипетки аккуратно снимите верхний слой масла, оставив от 100 до 200 микролитров раствора для визуализации. Отрежьте кончик пипетки под углом. Используйте его для извлечения от 50 до 100 микролитров раствора GUV со дна пробирки. Чтобы инкапсулировать актин непосредственно в 96-луночный планшет, соедините 198 микролитров двух молярных глюкоз с 802 микролитрами воды для приготовления внешнего раствора глюкозы, соответствующего осмолярности внутренней смеси актина. Пассивируйте лунку 96-луночного планшета, добавив в лунку 100 микролитров BSA 10 граммов на литр. После 10-15-минутной инкубации промойте лунку пять раз 100 микролитрами наружного раствора. Оставьте 100 микролитров для окончательной стирки. Теперь аккуратно добавьте 50 микролитров липидно-масляной смеси в лунку, положив пипетку на боковую стенку, чтобы обеспечить правильное наслоение поверх внешнего раствора. В отдельную пробирку добавить 100 микролитров липида в масло, и выдержать. Добавьте 2,5 микролитра конечного раствора актина в инкубированную липидно-масляную трубку, позволяя ей опуститься в виде капель. Слегка постучите по дну трубки от 10 до 20 раз, пока смесь не станет мутной. Аккуратно пипетируйте эмульсию в центре масляного монослоя в скважине, не нарушая границу раздела. Затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 200 г в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Дайте планшету остыть до комнатной температуры в течение 30 минут перед визуализацией. Были получены гигантские униламеллярные везикулы, или GUV, с мембранами, разделенными на жидкостно-неупорядоченные и жидкостно-упорядоченные домены, и с высоким выходом везикул размером от 5 до 30 микрометров. Сети FtsZ были рекапитуляции в пределах GUV и преимущественно локализованы в жидкостно-неупорядоченных мембранных доменах в присутствии GTP и Ficoll 70. Актиновые сети при восстановлении представляли собой тонкие пучки, прилипающие к мембране и образующие редкие паутинистые структуры. Без биотинилированных липидов актиновые пучки не прилипали к мембране, а вместо этого оставались жесткими и прямыми в просвете везикулы. В более высоких условиях центрифугирования везикулы, содержащие актин-миозин, агрегируются в упакованную тканеподобную архитектуру в производственной скважине.