Обнаружение метаболизма в живых клетках в реальном времени с помощью гиперполяризованного ¹³С ЯМР

Мы разработали неинвазивный метод измерения метаболизма сыворотки крови в реальном времени с использованием передовых методов гиперполяризованного ЯМР. Наша цель — создание доступных инструментов для различных прикладных биологических исследований. Сообщалось о нескольких гиперполяризованных системах ЯМР для метаболизма в сыворотке крови. Тем не менее, стандартизированные и воспроизводимые протоколы для более широкого внедрения исследований до сих пор не были доступны.

Наш протокол повышает доступность с помощью коммерчески доступных компонентов. Кроме того, мы обеспечиваем всестороннюю валидацию, в том числе преимущества смешивания систем и возможности повторных измерений для более широкой адаптации. Наши результаты позволяют отслеживать динамические метаболические изменения в живых клетках в режиме реального времени, не отвлекаясь. Это открывает новые возможности для долгосрочных исследований лекарств в различных областях применения метаболических зондов.

Наш подход имеет ограничения, в том числе варианты проб и требования к автоматизации. Решение этих проблем позволит создать методы измерения клеточного метаболизма и обогатит исследовательские усилия нашей лаборатории в области ДНФ в будущем.

[Рассказчик] Для начала добавьте два миллилитра 0,25% объемного раствора трипсина ЭДТА в 10-сантиметровую посуду. Осторожно наклоните блюдо, чтобы покрыть всю поверхность. Затем отсасывайте избыток раствора трипсина этилендиаминэтрицензиновой кислоты. Поместите блюдо в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия, и высиживайте в течение двух минут. Затем добавьте в блюдо 10 миллилитров питательной среды. С помощью пипетки аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить клетки от поверхности и собрать всю клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Теперь возьмите примерно 10 микролитров клеточной суспензии и загрузите ее в счетчик клеток, чтобы определить количество клеток. Убедитесь, что измеренное количество элементов подтверждает выход примерно в 10 миллионов ячеек, или отрегулируйте по мере необходимости. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию при 120 х г в течение пяти минут. После центрифугирования аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте полученную клеточную гранулу в четырех миллилитрах 2% весового раствора альгината и медленно пипеткуйте, чтобы свести к минимуму образование пузырьков. Теперь добавьте 10 миллилитров 50 миллимолярного раствора хлорида кальция в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Закрепите шприц на колпачке центрифужной пробирки, содержащей раствор хлорида кальция. Наберите 300 микролитров смеси клеточного альгината в шприц объемом 0,5 миллилитра, оснащенный 10-миллиметровой иглой трех калибра. Затем плотно закройте пробирку центрифуги шприцем, закрепленным на крышке, и поместите сборку в центрифугу для осторожного вращения при 200 x g в течение пяти минут. После центрифугирования надосадочную жидкость удалить надосадочную жидкость и суспендировать полученный гель в питательной среде. Затем с помощью пипетки Пастера перенесите инкапсулированный гель в ЯМР-трубку и вставьте приспособление для губки, чтобы обеспечить плотное прилегание. Подогрейте средний резервуар, содержащий 5% объемного оксида дейтерия, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Начните циркуляцию со скоростью примерно 500 микролитров в час, чтобы стабилизировать условия. Прежде чем продолжить, осмотрите установку, чтобы убедиться в отсутствии утечек. Добавьте 18 микролитров меченой углеродом 13-меченой пировиноградной кислоты в концентрации 14,2 моляра, легированной 25 миллимоляром OX063, во флакон с образцом. Подсоедините флакон к текучему тракту системы динамического поляризатора ядерной поляризации. Далее вставляем подключенный флакон в узел отверстия динамического ядерного поляризатора. Применяйте микроволновое излучение с частотой около 188 гигагерц и мощностью 22 милливатта в течение 60-80 минут. Используйте твердотельный спектрометр ядерного магнитного резонанса, интегрированный в систему динамической ядерной поляризации, для мониторинга интенсивности сигнала углерода 13. Записывайте данные сигнала каждые пять минут с помощью программного обеспечения для управления системой. Теперь быстро растворите поляризованный образец в 3,2 миллилитрах буфера для растворения, предварительно нагретом до биологической температуры. Загрузите подготовленный образец в ЯМР-пробирку и вставьте пробирку в спектрометр. На ЯМР-консоли инициируйте автоматизированную процедуру синхронизации, настройки, согласования и шимминга с образцом на месте для обеспечения оптимального спектрального разрешения и стабильности сигнала. Загрузите последовательность захвата углеродного 13-го импульса с включенной развязкой протонов, используя настройку, например 13-CPD. Установите угол поворота на 90 градусов с помощью импульса в одну микросекунду, обозначенного как P1. Затем определите время сбора данных как 1,376 секунды, спектральную ширину как 23 663 герц, а точки захвата, или TD, как 65 536. Установите задержку релаксации D1 на ноль секунд. Назначьте TD1 150 временных приращений для получения 150 последовательных спектров в псевдо-2-мерном режиме и отрегулируйте усиление приемника на низкое значение, например приблизительно единицу, чтобы избежать насыщения сигнала, вызванного гиперполяризованными выборками. Теперь остановите перистальтический насос, чтобы временно остановить циркуляцию среды, прежде чем вводить гиперполяризованный раствор через входную трубку. Начните сбор спектрального сигнала примерно за 10 секунд до растворения гиперполяризованной подложки, чтобы обеспечить захват сигнала по прибытии в место обнаружения. Когда раствор выйдет из поляризатора с динамической ядерной поляризацией, наберите один миллилитр его в шприц. Переключите трехходовой клапан на входе в биореактор в положение B, чтобы направить гиперполяризованный раствор в ЯМР-трубку. После завершения впрыска переключите клапан обратно в положение A, чтобы возобновить циркуляцию среды и предотвратить обратный поток. Наконец, подтвердите, что инжекция прошла успешно, после того, как было отмечено увеличение сигнала затухания свободной индукции в программном обеспечении для сбора данных. Убедитесь, что конечный раствор достигает температуры от 308 до 313 Кельвинов и pH около семи перед передачей на измерение ЯМР. С интервалом в 1,5 часа были получены спектры ЯМР гиперполяризованной углерод-13 одного и того же образца, инкапсулированного клеткой SCCVII, для оценки возможности повторных неразрушающих измерений. Первое измерение ЯМР показало заметно повышенный сигнал лактата, что указывает на активное метаболическое превращение пирувата в лактат. Последующие измерения с интервалом в 1,5 часа выявили прогрессирующее снижение интенсивности сигнала лактата, что указывает на снижение метаболической активности с течением времени. В клетках HeLa первоначальные измерения подтвердили успешную конверсию пирувата в лактат с четко различимыми сигнальными пиками. Несмотря на то, что сигнал постепенно уменьшался из-за релаксации Т2, соотношение сигнал/шум оставалось адекватным в течение 60 секунд регистрации, что позволяет предположить, что текущий протокол широко применим и может служить универсальным инструментом для метаболического профилирования в реальном времени в различных типах клеток.