Асимбиотическое проращивание и регенерация листьев находящейся под угрозой исчезновения лекарственной орхидеи Hemipilia cucullata из зрелых семян

Мои исследования сосредоточены на оптимизации протоколов культивирования тканей для орхидей, находящихся под угрозой исчезновения, для улучшения сохранения, широкомасштабного размножения и устойчивого использования этих ценных лекарственных растений. Основной проблемой является достижение стабильных скоростей прорастания и регенерации для всех видов орхидей, поскольку каждый из них требует оптимизации среды для конкретных видов и точного контроля условий роста. Мы разработали эффективные протоколы культивирования тканей для нескольких исчезающих растений, что позволяет восстанавливать виды и способствует восстановлению естественной среды обитания.

Не существует эффективной воспроизводимой системы культивирования тканей для обработки, размножения, восстановления и консервации Hemipilia cucullata. Наземные орхидеи часто нуждаются в специфических симбиотических грибах, выделение и идентификация которых сложны. Симбиотический метод упрощает размножение и обходит эти этапы.

Наши практические решения обеспечивают высокую всхожесть и быструю регенерацию растений из зрелых состояний, устраняя грибковую зависимость и предлагая более быстрый и надежный подход к размножению Hemipilia cucullata. Для начала поместите капсулу в стакан. Добавьте одну-две капли моющего средства в стакан для полоскания.

Промойте капсулу под проточной водой из-под крана в течение пяти минут. Затем с помощью стерильной абсорбирующей бумаги удалите остатки поверхностной воды из капсулы. Теперь погрузите капсулу в 75% этанол на 30 секунд.

Простерилизуйте капсулу, погрузив ее в 50 миллилитров 20% раствора гипохлорита натрия, содержащего примерно 5% доступного хлора. Затем добавьте в раствор две капли неразбавленного бытового средства для мытья посуды и выдержите капсулу в течение 10 – 12 минут. Промойте капсулу пять раз стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить остатки дезинфицирующего средства.

Затем с помощью стерильного скальпеля удалите примерно один миллиметр с верхушки и цветоножки капсулы. Сделайте небольшой надрез на верхнем конце капсулы, чтобы обнажить семена и соберите их в стерильную чашку Петри. С помощью стерильных щипцов равномерно распределить примерно от 500 до 600 семян в каждой питательной бутылке, содержащей приготовленную среду.

Дайте семенам впитать воду и осесть на дне жидкой среды. Поддерживайте культуру при температуре 25 градусов Цельсия с 12-часовым циклом света и темноты и интенсивностью света 36 микромолей на квадратный метр в секунду. Наблюдайте за всхожестью семян еженедельно.

Запишите все видимые морфологические изменения и сфотографируйте культуры для документирования. Отбирайте здоровые саженцы размером от одного до двух сантиметров без видимого почернения или полного пожелтения для удлинения побегов. Используя стерилизованные и охлажденные щипцы, асептически перенесите 8-12 ростков в каждую бутылку, содержащую свежеприготовленную среду для удлинения побегов.

Равномерно распределите ростки внутри каждой бутылки. После пяти недель удлинения побегов выберите саженцы с полностью развитыми побегами и здоровыми листьями для отбора образцов листьев. Полностью разрыхленные стерильные листья вырезают со здорового ростка с помощью стерильного скальпеля.

Удалите верхушечную область и края листьев. Затем разрежьте каждый лист на сегменты примерно 0,5 на 0,5 сантиметра с помощью стерильного скальпеля в асептических условиях. Поместите 10 сегментов листа на индукционную среду PLB адаксиальной поверхностью вверх.

Убедитесь, что каждый сегмент плотно соприкасается со средой. Затем культивируйте их в течение пяти недель. Наконец, оцените количество успешно индуцированных PLB и рассчитайте скорость индукции в процентах.

Запишите среднюю высоту бутона в сантиметрах и подсчитайте количество бутонов, образовавшихся на одну посадку. Прорастание семян в жидкой среде заметно характеризовалось появлением зеленых зародышей из семенной оболочки примерно через 60 дней, которые впоследствии формировали сферические протоклубки к 80-85 дням. Наибольшая всхожесть 72% была достигнута в жидкой среде с добавлением 0,5 мг на литр NAA.

Среда В5, содержащая 0,5 мг на литр бензиладенина и 0,2 мг на литр NAA, давала самую высокую скорость протокорма, в среднем 5,3 новообразованных протокорма на эксплант. Протоклубнелуковицы, культивируемые в среде B5 с оптимизированной комбинацией регуляторов роста, показали энергичный рост и здоровую зеленую пигментацию, превосходящую те, которые выращивались на среде MS в тех же условиях. Наибольшее количество ветвей на растение, в среднем четыре, наблюдалось при концентрации одного миллиграмма на литр каждого бензиладенина и NAA, за которым следовал только NAA (0,5 мг на литр).

Удлинение побега было наиболее усилено при комбинации 0,5 мг на литр бензиладенина и одного миллиграмма на литр NAA, в результате чего средняя высота рассадки составила 4,8 сантиметра. Самая высокая скорость индукции протокормоподобных тел (44,3%) была достигнута при использовании бензиладенина в три миллиграмма на литр с 0,2 миллиграмма на литр NAA.