Визуализация движений центромеры во время мейотической профазы у самцов Arabidopsis thaliana

Наше исследование посвящено мейозу растений с целью выявить молекулярные механизмы, направляющие распознавание, выравнивание и парирование гомологичных хромосом в ходе мейотического прогрессирования. Задача заключается в визуализации движения хромосом в мейотических профилях, требуя живой визуализации тканей с высоким разрешением и скоростью для отслеживания траекторий. Для начала снимите защитную плёнку с одной стороны прокладки и разместите её в центре стеклянного затвора.

Затем снимите вторую защитную пленку. Залейте восемь микролитров водопроводной воды в центр прокладки. С помощью щипцов вырвите соцветие с одного из основных стеблей.

Поместите соцветие на новый слайд, размещённый под стереомикроскопом с линейкой. Выбирайте цветочные бутоны длиной примерно 0,5 миллиметра. С помощью острых иголок аккуратно раскройте бутоны, раздвигая чашелистики и лепестки, чтобы сохранить только пыльники.

Аккуратно переместите пучки пыльников в воду в полости спейсера сразу после удаления чашелистиков и лепестков, чтобы предотвратить обезвоживание. Отложите несколько пучков внутри спейсерной полости. Чтобы закрыть затвор с помощью защитного скользя и избежать воздушных пузырьков, добавьте восемь микролитров воды на накладку.

Затем аккуратно переверните стекло крышки так, чтобы капля воды была обращена к полости прокладки. Убедитесь, что пучки погружён в 16 микролитров воды, а крышка хорошо прилипает к прокладке. Настройте микроскоп, возбуждая GFP на 488 нанометрах и обнаруживая его гибридным детектором от 494 до 547 нанометров.

Затем локализируйте пыльницу с помощью яркого освещения. Используя канал яркого поля, определите мейотическую стадию на основе формы клеток. Визуализируйте антера в программном обеспечении и используйте RFP-сигнал как дополнительный индикатор мейотической стадии клеток.

Для выполнения непрерывных захватов установите временной интервал равным нулю в временной секции. Затем используйте модуль точек для автоматического отслеживания пятен. Выберите зелёный источник и установите диаметр XY на один микрометр для центромеры с GFPCENH3 маркировкой.

Затем измените качество обнаружения в зависимости от интенсивности сигнала, используя график внизу окна управления. Используйте алгоритм авторегрессивного отслеживания движения для отслеживания траекторий центромер и визуализации всех траекторий, чтобы легко отличить мейоциты от соматических тканей. Далее используйте точечный модуль для отслеживания пятен на выбранном ядре с течением времени.

Определите область интереса, выбрав сегмент опциона только область интереса и проведите отслеживание спотов внутри него. Выберите область, которая действительно включает ядро во всех трёх измерениях и со временем. В графике родословной используйте 3D-просмотрщик программного обеспечения, чтобы визуализировать все траектории.

Удалите траектории за пределами анализируемого мейоцита, выбрав их и нажав клавишу delete на клавиатуре. В режиме редактирования удалите или добавьте объект, убедившись, что объект добавлен в правильную плоскость. В режиме редактирования треков вручную соединяйте новые объекты на графике родословной после тщательного анализа ячейки в 3D.

Вычислите мгновенную скорость на каждом шаге времени, чтобы отслеживать изменения скорости движения со временем. Вычислите угол поворота как изменение направления движения между последовательными временными шагами, чтобы выявить паттерны траектории. Храните результат вместе с мгновенной скоростью.

Вычислите коэффициент охвата с помощью Cell Tracker, чтобы измерить, насколько далеко отслеживаемый объект движется относительно его начальной позиции, что указывает на исследовательское поведение. Вычислите среднюю скорость для каждого пути, чтобы суммировать характеристики движения за период наблюдения. Рассчитайте средний угол поворота на трек, чтобы проанализировать движение, направление и поведенческие паттерны, а также сохранить результат.

Далее вычислите размер центроида на каждом шаге времени, чтобы измерить пространственную дисперсию центромеров вокруг их среднего положения. Используйте вариации размера центроида со временем для оценки глобальной согласованности по дорожкам центромеры и сохранения результата. Вычислить кросскорреляцию скорости для анализа взаимосвязей между динамикой движения различных отслеживаемых объектов, выявляя потенциальные координированные поведения.

Затем вычислите среднеквадратичное смещение для каждого пути, чтобы количественно оценить среднее квадратное расстояние, пройденное центромерами за заданный временной интервал. Мейотические центромеры демонстрировали значительно более высокую среднюю скорость — 109,35 нанометра в секунду по сравнению с соматическими центромерами. Мейотические центромеры показали более широкий диапазон и более высокий нормированный коэффициент охвата по сравнению с соматическими центромерами.

Распределение угла поворота различалось между мейотическими и соматическими центромерами. Среднее квадратное смещение мейотических центромер со временем увеличивалось, тогда как соматические центромеры оставались в основном статичными. Этот протокол позволил впервые количественно оценить движение мейотических хромосом в Arabidopsis, выявив впечатляющую динамику центромеров на стадии зиготена и пахитена.

Этот протокол позволяет изучать движения геномных областей во время мейотической профазы и может быть адаптирован для применения в других видах растений. Эта работа позволяет исследовать взаимодействие движения хромосом и рекомбинации, углубляя понимание механизмов, определяющих генетическое разнообразие во время формирования гамет.