Извлечение гистонов из клинических образцов для эпигенетического профилирования с помощью масс-спектрометрии

Область наших исследований заключается в анализе эпигенетических изменений в образцах рака, обнаружении новых диагностических и прогностических биомаркеров, а также выявлении потенциальной цели терапии. Основной проблемой с клиническими образцами является ограниченное количество материалов и артефактов, вызванных фиксацией. Однако благодаря оптимизированному рабочему процессу и DI чувствительности мы можем количественно оценить до 50 гистонных PTM всего из 1000 клеток.

Мы показываем, что масс-спектрометрия может количественно оценить изменения гистонного ПТМ в клинических образцах, предоставляя представление об эпигенетическом механизме и позволяя открывать биомаркеры и определять таргетные цели для точных эпигенетических терапий. Наш протокол учитывает необходимость надёжного, количественного и чувствительного профилирования гистонного ПТМ в различных клинических образцах. Масс-спектрометрия идеально подходит для анализа гистонного ПТМ, обеспечивая беспристрастное обнаружение, одновременное профилирование и совместное появление на одном пептиде, тем самым преодолевая ограничения методов на основе антител.

Для начала разморозьте свежезамороженную ткань на льду и с помощью скальпеля или лезвия отрежьте кусок примерно 20–30 миллиграммов, соответствующий примерно двум кубическим миллиметрам ткани. Перенесите образец разрезаной ткани в пробирку объёмом 1,5 миллилитра. С помощью ножниц измельчите ткань на мелкие кусочки.

Добавьте один миллилитр свежеприготовленного буфера для изоляции ядер, дополненного указанными ингибиторами протеаз, и снова измельчите ткань. Перенесите образец в гомогенизатор для подавления. Сначала используя свободный пестик, а затем тугой пестик, унифицируйте ткань до тех пор, пока не останется видимых частей.

Фильтруйте гомогенизированный образец через 100-микрометровый клеточный фильтр, чтобы удалить тканевые мусоры. Интенсивно обработайте фильтрованный образец вверх и вниз с помощью пипетки объемом 200 микролитров для растворения плазматической мембраны. Перенесите образец в новую трубку объёмом 1,5 миллилитра.

Поместите трубку в настольную центрифугу и вращайте при температуре 2 300 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы пеллетировать ядра. После отброса супернатанта снова суспензируйте ядерную гранулу в 50–100 микролитрах буфера изоляции ядер, дополнив 0,1% SDS для растворения ядерной мембраны. Затем добавьте 250 единиц нуклеазы бензоназы в ресуспендированный образец для переваривания нуклеиновых кислот.

Хорошо перемешайте и инкубуйте две минуты при 37 градусах Цельсия. Для оптимальной температуры резки замороженных образцов промывайте ткани с этаноловой водой и PBS перед измельчением и извлечением гистонов. Добавьте один миллилитр растворяющего парафина в образец FFPE, взятого в трубке объемом 1,5 миллилитра, и используйте вихрь на максимальной скорости в течение 30 секунд, пока парафин полностью не растворится.

Центрифугуйте образец при 16 000 г в течение трёх минут при комнатной температуре и аккуратно сбросьте супернатант с помощью пипетки с небольшим наконечником, чтобы избежать гранулы. Теперь добавьте один миллилитр 95% этанола в гранулу и вихрь на максимальной скорости в течение 30 секунд. Центрифугуйте образец при 16 000 G в течение трёх минут при комнатной температуре и сбросьте супернатант.

После увлажнения образца добавьте 200 микролитров экстракционного буфера в гранулу. Гомогенизуйте ткань в буфере экстракции, используя цифровой сигнал с помощью трёхмиллиметрового микронаконечника. После гомогенизации инкубировать образец в термомиксере и ненадолго открыть крышку трубки, чтобы формальдегид испарился.

После центрифугирования образца перенесите супернатант в новую маркированную пробирку. С помощью скальпеля вырезать гелевые полосы, соответствующие молекулярной массе белков гистонов ядра, находящихся от 10 до 18 килодальтон. После разрезания гелевых лент используйте тот же скальпель, чтобы переложить нарезанные кусочки геля в трубку объёмом 1,5 миллилитра.

Чтобы очистить гель, добавьте раствор 50% ацетонитрила в двойной дистиллированной воде и инкубировать трубку в термомиксере при 1 400 оборотах в минуту в течение 10 минут при комнатной температуре. Обезвоживайте детали геля, добавив 100% ацетонитрил. Смешайте в термомиксере при 1 400 оборотах в минуту в течение 10 минут при комнатной температуре.

После выброса супернатанта сушите гелевые детали в течение пяти минут при комнатной температуре в вакуумной центрифуге. Далее добавьте 15 микролитров 7,7-молярного раствора пропоникангидрида и 26 микролитров одного молярного аммония бикарбоната в каждую трубку и инкубируете. Затем инкубировать образец 80 микролитрами одного молярного аммония бикарбоната.

Затем промывайте гелевые кусочки три раза двойной дистиллированной водой и сбрасывайте жидкость после каждой инкубации. Далее добавьте 50% ацетон-нитрила в гелевые изделия и инкубуйте при 1 400 оборотах в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 100% ацетонитрил, чтобы полностью обезвожить кусочки геля.

Инкубировать в термомиксере при 1 400 оборотах в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. После выброса жидкости сушите гелевые детали в течение пяти минут при комнатной температуре в вакуумной центрифуге. Добавьте четыре микролитра раствора трипсина и 20 микролитров буфера для пищеварения в каждую тюбик с кусочками геля.

Инкубировать трубки на льду в течение 10 минут, чтобы трипсин мог впитаться в гель. Когда трипсин полностью впитается, добавьте 80 микролитров буфера для пищеварения, чтобы полностью покрыть кусочки геля, и инкубируйте трубки на ночь при температуре 37 градусов Цельсия в термомиксере. Для извлечения переваренных пептидов добавьте 100 микролитров 100% ацето нитрила в каждую трубку и инкубируете при 1 400 оборотах в минуту в течение 20 минут при комнатной температуре в термомиксере.

Теперь аккуратно соберите супернатант и переместите его в новую трубку объёмом 1,5 миллилитра. После повторного извлечения ацето нитро с оставшимся гелем объединяйте супернатанты. Концентрируйте собранные пептиды в вакуумной центрифуге до объёма от одного до пяти микролитров.

Затем добавьте два микролитра одного молярного триэтиламмония бикарбоната и три микролитра раствора фенилизоцианата. Инкубировать образец при 350 оборотах в минуту в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия в термомиксере. Чтобы остановить деривитизацию, добавьте восемь микролитров 1% трихлоруксусной кислоты в каждую пробирку.

В завершение разведите каждый образец, добавив 100 микролитров буфера A и загрузите разбавленные образцы на наконечники ступени C18 для элаживания. Экстракция гистонов была успешно проведена из свежих замороженных, OCT и FFPE образцов с использованием дифференциальных рабочих процессов обработки, специфичных для каждого типа ткани. Несмотря на более низкое обогащение и наличие фонового белка, гистоны H3, H2A, H2B и H4 были успешно извлечены из образцов FFPE, что подтверждается диапазонами в FFPE1 и FFPE2 LANE, что соответствует примерно одному микрограмму стандарта H3.1.

Наножидкая хроматография и MS анализ гистонов, полученных из FFPE, показали успешное разделение гистоновых пептидов на 55-минутном градиенте с чёткими пиками времени удержания, зафиксированными в общей ионной хроматограмме. Экстракцированные ионные хроматограммы подтвердили обнаружение и количественную оценку немодифицированных и метилированных форм H3 K четырёх с отдельными профилями элюции для каждого значения M на Z. Это позволяет рассчитывать процент относительного количества для каждой модификации.

Сравнительный анализ модификаций гистонов между нормальными и опухолевыми образцами выявил значительное увеличение определённых типов и уменьшение других типов опухолевых тканей.