Использование инструментов оптогенетики LEXY и LINuS и автоматизированного анализа изображений для количественной оценки динамики нуклеоцитоплазматического транспорта в живых клетках

Наша лаборатория изучает взаимодействие между ядерными порами и организацией хроматина. Таким образом, мы изучаем, как ядерные поры влияют на организацию хроматина, но и наоборот, влияет ли организация хроматина на функцию ядерных пор, особенно в нуклеоцитоплазматическом транспорте. Нуклеоцитоплазматический транспорт является очень быстрым процессом, поэтому одной из задач является обнаружение изменений в динамике нуклеоцитоплазматического транспорта в живых клетках.

Существует не так много инструментов для мониторинга нуклеоцитоплазматического транспорта в живых клетках. Внедряя полуавтоматизированную и улучшенную технику, мы надеемся облегчить использование этих инструментов. Наш протокол основан на глубоком обучении.

Это ограничивает погрешность и значительно сокращает время, необходимое для анализа. То, что раньше занимало целый день, теперь занимает всего один или два часа. Для начала запустите программное обеспечение FIJI в компьютерной системе.

Выберите стабильную фазу в качестве первого изображения, фазу освещения в качестве второго изображения, а фазу восстановления в качестве третьего изображения. Объедините три изображения, представляющие три фазы, чтобы получить одно изображение. Сохраните полученное объединенное изображение для сегментации, перейдя в раздел «Файл» и выбрав «Сохранить как TIFF».

Затем разделите канал mCherry, выбрав «Изображение», «Цвет» и «Разделить каналы». Затем сохраните разделенное изображение, перейдя в Файл, Сохранить как и TIFF. Чтобы проверить наличие обесцвечивания во время сбора, последовательно выберите «Изображение», «Стопки» и «Построить профиль оси Z».

Затем нажмите «Данные», затем «Копировать первый набор данных» и вставьте его в предоставленную таблицу под ячейкой профиля оси Z. Теперь нарисуйте круглую область интереса, приблизительно равную среднему размеру ядра, нажав на «Анализ», затем на «Инструменты» и на «Менеджер ROI». Добавьте ROI и сохраните его, перейдя в раздел «Еще» и нажав «Сохранить».

Поместите сохраненный ROI в область, свободную от ячеек, во время интервальной съемки. Убедитесь, что среднее значение серого выбрано" в разделе "Анализ и установка измерений". Затем нажмите на Еще, Мультимер.

Отметьте «Измерить все 50 срезов» и «Один ROI на срез» и нажмите «ОК», чтобы записать интенсивность. Скопируйте и вставьте все измеренные значения интенсивности в предоставленную таблицу в ячейку фона ROI. Затем закройте изображение только с каналом mCherry и выберите сохраненное изображение с объединенными каналами.

Теперь откройте плагин TrackMate, последовательно кликнув на Плагины, Трекинг и TrackMate. Убедитесь, что временные точки находятся в диапазоне от нуля до 49, и нажмите «Далее». Выберите детектор StarDist и нажмите «Далее».

Выберите второй канал, SiR-ДНК, для сегментации ядер и дождитесь завершения процесса. Оставьте параметры по умолчанию в окне пороговых значений и нажмите Далее. Создайте фильтры с использованием Mean Intensity, Channel One, чтобы исключить ядра с экстремальными значениями сигнала.

Создайте один фильтр для выбора значений выше заданного порогового значения, а другой — для выбора значений ниже порогового значения. Аналогичным образом, добавьте два фильтра областей для удаления мусора или умирающих клеток и нажмите Далее. Выберите трекер Simple LAP и нажмите Далее.

Далее настройте параметры трекинга. Установите для параметра Максимальное расстояние связывания значение 30 микрометров, для параметра Максимальное расстояние для закрытия зазора значение 15 микрометров и для параметра Максимальный зазор для закрытия зазора равным трем. Затем нажмите «Далее».

После расчетов нажмите на кнопку Далее, чтобы установить фильтры по трекам. Чтобы выбрать только те ядра, которые отслеживались в течение всего временного цикла, выберите наибольшее количество точек на треке и нажмите кнопку Далее. Затем отметьте галочкой "Отображать имена пятен", чтобы проследить каждое ядро в дальнейших анализах и настроить другие функции отображения по своему усмотрению.

Внизу страницы нажмите «Треки» и выберите «Экспорт в CSV», чтобы сохранить таблицу измерений. Закройте таблицу и нажмите кнопку Далее. Теперь нажмите на Capture overlay" в качестве действия, а затем нажмите на Execute, а затем OK, чтобы создать изображение с отслеживаемыми ядрами.

Сохраните изображение, последовательно кликнув на Файл, Сохранить как и выбрав TIFF. Чтобы импортировать CSV-файл TrackMate в предоставленную таблицу, перейдите на вкладку «Данные». В группе "Получить преобразование данных" нажмите "Из текста/CSV" и нажмите "Импорт".

Скопируйте столбцы Spot IDB, Track IDC, Frame I и канал средней интенсивности 1M и вставьте их в столбцы от A до D предоставленной таблицы. Отсортируйте результаты в алфавитном порядке сначала по идентификатору дорожки, отдельному ядру, из ячейки B5, а затем по рамке, временной точке, из ячейки C5. Теперь откройте GraphPad Prism, создайте новый лист и скопируйте и вставьте столбец времени из таблицы. Затем вставьте полученные значения в виде относительной интенсивности ядер в таблицу GraphPad Prism.

Чтобы построить график относительной интенсивности ядерного излучения, перейдите в раздел График и выберите XY в качестве семейства графиков. Затем выберите Точки и соединительная линия с полосами погрешностей" в качестве типа графика. В настройках графика выберите «Среднее и погрешность» и «SEM», а затем нажмите OK. Затем, чтобы получить скорость экспорта, нажмите на «Новая таблица данных» и введите время в десятичных дробях только для стабильной фазы и фазы освещения.

Вставьте в таблицу значения, полученные в виде относительной ядерной интенсивности для этих фаз. В разделе «Результаты» нажмите на анализ XY, а затем на «Экспоненциальный». Затем выберите Нелинейная регрессия и нажмите OK. Выберите Plateau with with one phase decay" в качестве модели под параметрами.

Затем выберите константу, равную 2,25, как X0, константу, равную единице, как Y0, и константу, равную нулю, для плато. Укажите, что K должно быть больше нуля, и нажмите OK. Создайте новую таблицу и вставьте полученные значения K. В разделе Диаграмма выберите Столбец в качестве семейства диаграмм и выберите график скрипки в качестве типа диаграммы.

Выберите "Показать все точки" в качестве графика и нажмите OK. Экспорт ядра с помощью оптогенетического зонда лекси визуализировался с помощью визуализации живых клеток. В контрольных условиях с обработанными метанолом клетками интенсивность ядра mCherry резко снижалась после освещения синим светом, за чем следовало постепенное восстановление в фазе после осветления. Лечение ингибитором экспорта, лептомицином В, вызывало изменение ядерного экспорта, поскольку сигнал зонда оставался стабильно ядерным на протяжении всех временных точек.

Количественный анализ относительной ядерной интенсивности показал со временем медленное снижение до достижения плато в конце фазы освещения. Промежуточные концентрации лептомицина В должны демонстрировать умеренный ядерный экспорт. Скорость экспорта, рассчитанная на основе данных об интенсивности, подтвердила значительно более высокую скорость экспорта в клетках, обработанных метанолом, гораздо более низкую скорость при 0,5 наномолярном лептомицине B и почти полное отсутствие экспорта при одном наномолярном лептомицине B.