Экспансионная микроскопия: высокоразрешающая флуоресцентная визуализация с использованием обычного микроскопа

Мы — клеточные биологи, исследующие роль микротрубочек и их связанную функцию в различных модельных организмах. Наша цель — изучить их роль в организации клеток, морфогенезе, цилиогенезе и делении. За последние пять лет мы внесли вклад в понимание кругового молекулярного состава, особенно с помощью экспансионной микроскопии.

И этим мы раскрываем ключевую особенность их сборки и функции. Сочетая расширенную микроскопию с криофиксацией, наш протокол позволяет получить высококачественную визуализацию, сохраняя при этом почти родную структуру клеточного элемента, которая преодолевает основные ограничения микроскопии с высоким разрешением. Таким образом, расширенная микроскопия — это недорогая и простая в реализации методы, которые обеспечивают доступ ко всей лаборатории с сверхвысоким разрешением.

Для начала используйте шприц и иглу, чтобы наполнить каждую пятимиллилитровую трубку одним миллилитром дополнительного сухого ацетона под химическим капюшоном. Поставьте трубки вертикально на металлическую стойку и поместите их в жидкий азот для заморозки. Заполните половину коробки из полистирола размером 30 на 30 сантиметров с толстостенками сухим льдом, а затем заполните дьюар типа Vitrobot жидким азотом, пока испарение не прекратится.

Теперь выньте паука из аппарата для погружения и наполните металлическую камеру жидким этаном. Подождите 10 минут, чтобы этан достиг равновесия. Затем возьмите 12-миллиметровый ковершип с тонким пинцетом и нанесите его на папиросную бумагу, чтобы впитать лишний материал из накладки.

Держите крышку наполовину, используя пинцет с зажимным кольцом, совместимым с крио-плунжером. Поместите пинцет, удерживающий обложку, в держатель для крио-вантузов и используйте бумагу Whatman, чтобы промокнуть оставшийся материал. Активируйте крио-плунжер, чтобы погрузить коверслип в этановый раствор, содержащийся в металлической камере.

Затем быстро переложите накладку в трубку с замороженным ацетоном. Инкубировать трубы с покрытиями в сухом льду под углом примерно 45 градусов. Поставьте закрытый контейнер на орбитальный шейкер, установленный на 50–100 об/мин, и перемешивайте ночью при 4 градусах Цельсия, чтобы температура постепенно повышалась.

Далее удалите большую часть сухого льда из коробки. Продолжайте перемешивать орбитальный шейкер ещё 45 минут, чтобы температура поднялась с минус 80 градусов Цельсия до минус 20 градусов Цельсия. Кратковременно откройте и закройте каждую трубку, чтобы снять внутреннее давление.

Затем переложите каждую упаковку в 12-колодную пластину или подходящий контейнер, заранее заполненный предварительно охлаждённым раствором 100% этанола. После пятиминутной инкубации регидратировать покрытие через серию градированного этанола. После переноса покрытий в PBS поместите их под микроскоп.

Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно поцарапать поверхность и направить все накладки на правильную сторону вверх. Поместите крышку в четырёхяборную пластину, заполненную раствором 2%акриламида и 1,4%формальдегида в PBS. Затем инкубировать покрытия в этом растворе при 37 градусах Цельсия без перемешивания.

Затем разморозите 10% APS и раствор гелирования на льду в течение 10 минут перед гелированием. Подготовьте влажную камеру с использованием тонкого слоя влажной ткани и парапленки. Затем храните при четырёх градусах Цельсия.

Через 10 минут поместите влажную камеру на холодный блок для использования во время гелирования. Теперь удалите капли из раствора для закрепления белка и промокните лишнюю жидкость с помощью папиросной бумаги в два последовательных прохода. Добавьте APS в раствор гелирования для достижения конечной концентрации 0,5% и удержите вихрь на две-три секунды.

Затем нанесите пипетку двумя каплями по 35 микролитров на Parafilm в влажной камере и аккуратно нанесите каждую каплю на каплю, чтобы клетки были обращены вниз в раствор гелирования. Переведите влажную камеру в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 30–60 минут. Для денатурации используйте инструмент для биопсии диаметром 0,4 сантиметра, чтобы извлечь кусочки геля, и поместить их в пластину с шестью лунками, заполненную одним миллилитром буфера денатурации.

Перемешивать пластину 10–15 минут, пока гели не отсоединятся от накладок, и переложите отделённые детали геля в 1,5-миллилитровые микроцентрифугные трубки, заполненные свежим буфером для денатурации. Инкубировать гели в течение 90 минут при 95 градусах Цельсия. После инкубации переложите гели в двойную дистиллированную воду на 10 минут для мытья.

Измерьте диаметр гелей с помощью миллиметровой бумаги для оценки коэффициента расширения геля. Нанесите чистые покрытия примерно 200 микролитрами раствора полилизина. Инкубируйте коверслики в течение часа при комнатной температуре, затем трижды промывайте их двойным дистиллированным водой, чтобы удалить лишний полилизин.

После того как покрытия высохнут, храните их при четырёх градусах Цельсия до дальнейшего использования. Разместите гель правильно ориентированным, с клетками, направленными вверх, на бумагу без ворса и дайте им высохнуть, чтобы удалить лишнюю воду. Наконец, закрепите высушенные гели так, чтобы клетки были обращены вниз, на покрытые поли-D-Лизином покрытие для покрытия.

Криофиксация эффективнее сохраняла митохондриальную сеть в клетках RPE1, чем фиксация PFA, что показало окрашивание эфира NHS и ATP5A, а также позволяла разрешать митохондриальные кресты, которые не были видны при фиксации PFA. Криофиксация позволила лучше сохранять динамические микротрубочки, включая цитоплазматические и астральные микротрубочки в митотических клетках RPE1, по сравнению с фиксацией PFA. Криофиксация Trypanosoma brucei лучше сохраняла архитектуру митохондрии и общую клеточную структуру по сравнению с фиксацией PFA, что визуализируется при окрашивании TDH и NHS эфирным окрашиванием.

Кроме того, криофиксация лучше сохраняла эндоплазматический ретикулум, чем фиксация PFA на основе окрашивания BIP. Трещины наблюдались в криофиксированных клетках RPE1, но они не нарушали ультраструктуру органелл, таких как митохондрии или микротрубочки. Плохая криофиксация была отмечена пузырькообразными структурами и волнистыми микротрубочками, сопровождавшейся потерей целостности мембранных органелл.

Качество расширения зависело от прозрачности растворов акрилата натрия: пригодные растворы выглядели бесцветными или слегка жёлтыми и прозрачными, а непригодные — мутными и оранжевыми.