Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Добро пожаловать в лабораторию доктора Хику Алге Блинка. Мы хотели бы поблагодарить Калифорнийский институт регенеративной медицины за финансирование этого проекта. Мечение стволовых клеток флуоресцентным контрастным веществом позволяет in vivo отслеживать трансплантированные стволовые клетки in vivo.

Последующая оптическая визуализация меченых стволовых клеток позволяет проводить лонгитюдные исследования, в которых можно неинвазивно наблюдать за миграцией клеток in vivo. В этом видео вы узнаете, как маркировать флуоресцентными красителями как эмбриональные стволовые клетки человека, так и мезенхимальные стволовые клетки человека. Здравствуйте, я Софи Боддингтон из исследовательской группы по контрастным веществам на факультете радиологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Сегодня я хотел бы показать вам две различные методики мечения стволовых клеток флуоресцентными контрастными веществами. Один для мечения мезенхимальных стволовых клеток флуоресцентным красителем DID, а другой для мечения эмбриональных стволовых клеток человека эндигной ингрой. Позвольте мне начать с демонстрации нашей методики мечения мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью ДРИ.

Чтобы начать процедуру мечения мезенхимальных стволовых клеток, мы должны попробовать анизировать и посчитать их, чтобы получить суспензию с определенным количеством клеток. Так как это стандартная методика культивирования тканей, мы не будем показывать ее подробно. Мы хотим суспензировать клетки, которые мы будем помечать, с плотностью 1 миллион клеток на миллилитр в бессывороточной питательной среде.

Сначала добавляем пять микролитров контрастного вещества DID на миллилитр клеточной суспензии. Теперь смешиваем раствор щадящим пипетированием, клетки инкубируем с раствором для мечения в шестилуночной чашке с низким прикреплением при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. После того, как простая инкубация завершена, мы должны перелить раствор клетки в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Мы центрифугируем его при 400 RCF в течение пяти минут. Затем мы отсасываем маркировочный материал, следя за тем, чтобы он не потревожил гранулу. Теперь промываем клетки PBS.

Мы пипетируем клетки вверх и вниз, стараясь разбить палитру клеток. Последние два шага. Повторяем еще два раза, чтобы у нас получилось всего три этапа стирки.

Теперь мы подсчитываем клетки и проводим тройной и синий тест для определения жизнеспособности клеток. После определения жизнеспособности клеток ваши клетки теперь готовы к визуализации в оптическом тепловизоре. Чтобы начать процедуру мечения человеческих эмбриональных стволовых клеток, мы должны сначала приготовить контрастное вещество, известное как индоцианин Грин.

Затем мы смешиваем его с агентом для трансфекции, известным как протамин. Для начала отмеряем один миллиграмм зеленого порошка индоцианина и растворяем его в ста микролитрах ДМСО. Добавляем в смесь 400 микролитров DMEM, содержащего 10% FCS и хорошо встряхиваем, в результате чего у нас получается концентрация два миллиграмм на миллилитр индоцианина зеленого.

Далее мы добавляем трансфекционный агент протамин, который действует как челнок для контрастного вещества, позволяя ему более эффективно проникать в клетку. Теперь смешиваем пять микролитров сульфата протамина в соотношении 10 миллиграмм на миллилитр с 300 микролитрами ICG и 300 микролитрами сывороточного DMEM. Теперь мы встряхиваем новый раствор трансфекта в течение пяти минут, чтобы дать образоваться комплексам.

Далее отсасываем старые среды и добавляем в ячейки 10 миллилитров PREWARM DMEM. Добавляем в клетки заранее приготовленный раствор протамина ICG и начинаем часовую инкубацию, поместив чашку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как инкубация будет завершена, вынимаем чашку из инкубатора, отсасываем раствор для маркировки и промываем ячейки, ополоснув чашку пятью миллилитрами PBS.

Затем клетки подгоняют в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Встряхивание посуды поможет поднять клетки во взвешенном состоянии. Теперь аккуратно пипетируем вверх и вниз, чтобы разбить оставшиеся колонии.

Мы нейтрализуем трипсин, добавляя в блюдо равное количество DMEM, содержащего 10% FCS. Далее переносим клеточный раствор в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируем раствор при 400 RCF в течение пяти минут. Мы ресуспендируем клетки в полной среде.

Теперь мы можем избавиться от остаточных комков или комплексов, пропуская клетки через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров. Как только у нас есть раствор для свободных клеток, мы отсаживаем старую среду и ресуспендируем гранулу в предварительно дегельминтизированной полной среде из эмбриональных стволовых клеток человека. На этом этапе нам нужно отделить клетки-кормушки мыши от эмбриональных стволовых клеток человека.

Это делается для того, чтобы потом мы визуализировали только стволовые клетки. Для этого переносим раствор ячейки в покрытую желатином 10-сантиметровую чашку Петри. Помещаем блюдо в инкубатор с температурой 37 градусов и оставляем на 45 минут.

В течение этого времени следите за тем, чтобы не тревожить блюдо. Теперь кормушки будут прилипать к чашке, а стволовые клетки – нет. Мы переносим раствор из чашки Петри, и теперь у нас есть меченый одноклеточный раствор эмбриональных стволовых клеток человека.

Теперь мы можем посчитать клетки и провести на них тест в синем цвете. После подтверждения жизнеспособности наши клетки готовы к визуализации. На слайде показан пример того, как стволовые клетки могут быть визуализированы in vivo у мышей после того, как они были помечены флуоресцентным контрастным веществом и введены с помощью инъекции IP.

Серийная оптическая визуализация показала первоначальное накопление клеток в легких, за которым последовало перераспределение в печени, костном мозге конечностей и щитовидной железе. Флуоресцентная метка также может быть использована для прямого изображения трансплантированных стволовых клеток в образцах гистопатологии с помощью флуоресцентной микроскопии. Мы только что показали вам, как мечить стволовые клетки флуоресцентными контрастными веществами при выполнении мечения клеток.

Важно помнить о стандартизации каждого шага. Мы делаем это для того, чтобы обеспечить стабильную эффективность мечения и жизнеспособность клеток, чтобы можно было сравнивать результаты различных экспериментов. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в маркировке клеток.