Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Добро пожаловать в лабораторию доктора Хику Алдж Блинк. Мы выражаем благодарность Калифорнийскому институту регенеративной медицины за финансирование данного проекта. Маркировка стволовых клеток флуоресцентным контрастным веществом позволяет осуществлять отслеживание трансплантированных стволовых клеток in vivo.

Последующая оптическая визуализация меченых стволовых клеток позволяет проводить лонгитюдные исследования, в ходе которых можно неинвазивно контролировать миграцию клеток in vivo. В этом видео будет показано, как маркировать флуоресцентными красителями как эмбриональные стволовые клетки человека, так и мезенхимальные стволовые клетки человека. Здравствуйте, я Софи Боддингтон из исследовательской группы по контрастным веществам кафедры радиологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Сегодня я хочу продемонстрировать вам две разные методики маркировки стволовых клеток с помощью флуоресцентных контрастных агентов. Первая предназначена для маркировки мезенхимальных стволовых клеток флуоресцентным красителем DID, а вторая — для маркировки эмбриональных стволовых клеток человека с помощью endign ingra. Итак, позвольте мне начать с демонстрации нашей методики маркировки мезенхимальных стволовых клеток человека красителем DID.

Для начала процедуры маркировки мезенхимальных стволовых клеток необходимо трипсинизировать и подсчитать их, чтобы получить суспензию с определенным количеством клеток. Поскольку это стандартный метод культивирования тканей, мы не будем демонстрировать его подробно. Нам необходимо суспендировать клетки, которые будут подвергнуты маркировке, в безсывороточной культуральной среде с плотностью 1 миллион клеток на мл.

Сначала мы добавляем 5 µL контрастного вещества DID на 1 mL клеточной суспензии. Затем мы перемешиваем раствор осторожным пипетированием; клетки инкубируют с маркирующим раствором в 6-луночном планшете с низкой адгезией при 37 °C в течение 20 минут. По завершении инкубации необходимо перенести клеточный раствор в центрифужную пробирку объемом 15 mL.

Мы центрифугируем пробу при 400 RCF в течение пяти минут. Затем мы аспирируем маркирующую среду, стараясь не потревожить осадок. После этого мы промываем клетки раствором PBS.

Мы перемешиваем клетки, пипетируя их вверх и вниз, чтобы полностью разрушить клеточный осадок. Последние два этапа мы повторяем еще дважды, чтобы в сумме получилось три цикла промывки.

Теперь мы подсчитываем количество клеток и проводим тест с трипановым синим для определения жизнеспособности клеток. После определения жизнеспособности ваши клетки готовы к визуализации в оптическом сканере. Чтобы приступить к процедуре маркировки эмбриональных стволовых клеток человека, нам сначала необходимо подготовить контрастное вещество, известное как индоцианин зеленый.

Затем мы смешиваем полученный раствор с трансфекционным агентом, известным как протамин. Для начала мы отмеряем 1 mg порошка индоцианина зеленого и растворяем его в 100 µL DMSO. К смеси добавляют 400 µL DMEM, содержащего 10% FCS, и тщательно перемешивают; в результате получается раствор индоцианина зеленого с концентрацией 2 mg/mL.

Затем мы добавляем агент для трансфекции протамин, который служит переносчиком контрастного вещества, обеспечивая его более эффективное проникновение в клетку. Теперь смешиваем 5 µL сульфата протамина в концентрации 10 mg/mL с 300 µL ICG и 300 µL безсывороточной среды DMEM. Затем встряхиваем полученный раствор для трансфекции в течение пяти минут для формирования комплексов.

Затем мы аспирируем старую среду и добавляем к клеткам 10 milliliters ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ПОДОГРЕТОГО DMEM. Мы добавляем к клеткам ранее приготовленный раствор протамина с ICG и начинаем часовую инкубацию, поместив чашку в инкубатор при 37 °C. По завершении инкубации мы извлекаем чашку из инкубатора, аспирируем раствор для мечения и промываем клетки, ополаскивая чашку пятью milliliters PBS.

Затем клетки трипсинизируют в течение пяти минут при 37 °C. Встряхивание чашки поможет перевести клетки во взвесь. После этого осторожно пипетируют суспензию, чтобы разрушить оставшиеся колонии.

Мы нейтрализуем трипсин, добавляя в чашку равный объем DMEM, содержащего 10% FCS. Затем мы переносим клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируем ее при 400 RCF в течение пяти минут. После этого клетки ресуспендируют в полной среде.

Теперь мы можем избавиться от остаточных комков или комплексов, пропустив клетки через клеточный фильтр с размером пор 40 µm. Получив суспензию клеток без комков, мы аспирируем старую среду и ресуспендируем осадок в предварительно согретой полной среде для культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток. На данном этапе необходимо отделить фидерные клетки мыши от человеческих эмбриональных стволовых клеток.

Это делается для того, чтобы в дальнейшем визуализировать только стволовые клетки. Для этого мы переносим клеточную суспензию в 10-сантиметровую чашку Петри, покрытую желатином. Мы помещаем чашку в инкубатор при 37 °C и оставляем ее на 45 минут.

В течение этого времени следите за тем, чтобы не беспокоить чашку. Теперь фидерные клетки прикрепятся к поверхности чашки, а стволовые клетки — нет. Мы переносим раствор из чашки Петри, и теперь мы имеем маркированный раствор единичных человеческих эмбриональных стволовых клеток.

Теперь мы можем подсчитать количество клеток и провести тест на жизнеспособность с использованием трипанового синего. После подтверждения жизнеспособности клетки готовы к визуализации. На предметном стекле представлен пример того, как стволовые клетки могут быть визуализированы in vivo у мышей после их маркировки флуоресцентным контрастным агентом и введения путем внутрибрюшинной инъекции.

Последовательное оптическое сканирование показало первоначальное накопление клеток в легких с последующим перераспределением в печени, костном мозге конечностей и щитовидной железе. Флуоресцентная метка также может быть использована для прямой визуализации трансплантированных стволовых клеток в гистопатологических образцах с помощью флуоресцентной микроскопии. Мы только что продемонстрировали вам способ маркировки стволовых клеток флуоресцентными контрастными агентами при проведении клеточного мечения.

Важно помнить о необходимости стандартизации каждого этапа. Мы делаем это для обеспечения стабильной эффективности мечения и жизнеспособности клеток, чтобы результаты различных экспериментов можно было сравнивать. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в маркировке ваших клеток.