Создание системы выращивания чили трипсов (Scirtothrips dorsalis hood) для скрининга вирулентности энтомопатогенных грибов

Стручковый трипс является хорошо изученным вредителем на многих культурах. Наши исследования направлены на совершенствование системы селекции холодцового трипса и расширение ее применения для скрининга энтомопатогенных грибов для будущих экспериментов. Некоторые изучают альтернативы, такие как отделяющиеся листья, но ясные и подробные методы до сих пор не очень хорошо описаны.

В этом исследовании были разработаны новые методы массового выращивания трипсов, основанные на отделившихся листьях, которые могут обеспечить стабильные колонии трипсов. Кроме того, была разработана стабильная и воспроизводимая система биотестирования для скрининга вирулентности энтомопатогенных грибов. Этот протокол решает проблему отсутствия четкого стандартизированного метода освоения трипсов с использованием листового диска, уделяя особое внимание улучшению управления сценой и сокращению использования ресурсов.

Этот протокол упрощает контроль на стадии развития, снижает потребность в пространстве и рабочей силе, а также обеспечивает стабильные поставки трипсов, пригодных для крупномасштабных и надежных биотестов. Наша лаборатория сосредоточится на оптимизации методов массового выращивания и применении этого протокола к различным видам трипсов, улучшении окружающей среды и условий обработки для обеспечения стабильных и здоровых популяций для биотестов. Кроме того, система массового выращивания может быть расширена для использования в теплицах.

Для начала срежьте листья и цветы, зараженные трипсами чили. Переложите их в пластиковый пакет на молнии, убедившись, что пакет закрыт небольшим количеством воздуха внутри, чтобы разрывы оставались живыми. Далее приобретите стеклянный контейнер для выращивания размером 35 миллиметров в высоту и 45 миллиметров в диаметре.

Положите на дно контейнера три слоя круглого бумажного полотенца, каждый диаметром 40 миллиметров. Добавьте от 8 до 10 капель фильтрованной воды на бумажные полотенца для поддержания влажности. Теперь тщательно промойте молодой лист манго.

Рассмотрите его под оптическим микроскопом, чтобы проверить наличие яиц насекомых или других загрязнений насекомыми. С помощью резака для кожи разрежьте лист манго на круглый диск диаметром 40 миллиметров и положите его на влажное бумажное полотенце внутри стеклянного контейнера для выращивания. Понаблюдайте за трипсами чили под оптическим микроскопом при 10-кратном увеличении.

С помощью тонкой кисти для рисования переложите 10 взрослых трипсов, состоящих из пяти самцов и пяти самок, в подготовленный стеклянный контейнер для выращивания. Затем запечатайте каждый стеклянный контейнер для выращивания двумя слоями парапленки. Создайте около 40 маленьких отверстий в парапленке, используя булавку для насекомых с номером 0-0, чтобы обеспечить надлежащую вентиляцию.

Поместите герметичный стеклянный контейнер для выращивания в инкубатор на 48 часов. Наблюдайте за тканями листьев под стереомикроскопом, чтобы подтвердить наличие яиц, указывающих на положение яйцеклеток. Затем положите диск из свежих листьев манго на лист с яйцами и добавьте от 8 до 10 капель фильтрованной воды на бумажное полотенце для поддержания влажности.

Для содержания трипсов непосредственно перенесите лист, содержащий личинок первого возраста, в новую стеклянную емкость для выращивания. Наблюдайте за трипсами чили ежедневно. Для массового выращивания чилийского трипса сначала собирают самок взрослых трипсов из поддерживаемой популяции.

Переложите 10 самок взрослого трипса в подготовленную емкость для выращивания для получения яиц. Затем аккуратно перенесите примерно 120 личинок первого возраста в новый стеклянный контейнер для выращивания с помощью тонкой кисти. Для молекулярной идентификации соберите одного взрослого трипса чили в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Гомогенизируйте трипсы чили с помощью пеллетного пестика. Затем изолируют геномную ДНК с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя и амплифицируют с помощью PCR Master Mix. Проверьте ампликон ПЦР методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле для проверки результата амплификации.

Вырежьте целевую полосу размером примерно 658 пар оснований из геля. Выполните поиск взрывных работ в базе данных NCBI с использованием параметров по умолчанию для подтверждения идентичности вида. Для приготовления энтомопатогенных грибов добавьте два-три миллилитра 0,03%Tween 80 на поверхность грибной культуры возрастом от 10 до 14 дней, выращенной на агаре декстрозы Сабуро с концентрацией 1/4.

Аккуратно соскребите конидии с помощью стерильной петли. Переложите грибковую суспензию в чистую центрифугу объемом 15 миллилитров. Затем гомогенизируйте подвеску путем завихрения на максимальной скорости.

Отфильтруйте суспензию через фильтровальную бумагу, чтобы удалить мусор hyfil и получить чистую суспензию конидии. С помощью гемоцитометра проверьте количество конидий под световым микроскопом. Разведите суспензию до достижения концентрации 10 в степени 8 конидий на миллилитр.

Затем переложите конидиальную суспензию в стерилизованный ультрафиолетовым светом микрораспылитель для последующего применения биопробы. Соберите и вымойте молодые листья черники с черничной фермы. После сушки на воздухе осмотрите их поверхность под стереомикроскопом, чтобы проверить наличие оставшихся членистоногих или яиц, и удалите их, если они есть.

Теперь вырежьте листовой диск диаметром 2,8 сантиметра с помощью резака для кожи. Затем продезинфицируйте листовой диск в 1%-ном растворе гипохлорита натрия. И втроем дважды промойте его стерилизованной водой, чтобы удалить остатки отбеливателя.

Далее налейте три миллилитра 2,5%-ного водяного агара в небольшие стеклянные емкости внутри ламинарного вытяжного шкафа. Затем аккуратно перенесите адаксиальную сторону диска листа вверх на агар и слегка заделайте его так, чтобы над поверхностью оставалась только небольшая часть. Как только агар полностью застынет, считайте, что стеклянные емкости готовы к биопробе.

Перед нанесением тщательно проведите вихревую обработку конидиальной суспензии. С помощью микрораспылителя равномерно нанести 0,1 миллилитра суспензии на поверхность каждого листового диска с расстояния примерно 10 сантиметров внутрь стеклянной емкости. Теперь с помощью тонкой кисти для рисования перенесите 10 личинок второго возраста в каждую стеклянную емкость.

Запечатайте каждую емкость двумя слоями парапленки. Создайте в парафильме примерно 30 маленьких отверстий для вентиляции с помощью булавки от насекомых с номером 0-0. Затем поместите емкости в инкубатор на семь дней.

Наблюдайте и записывайте смертность трипсов чили под стереомикроскопом при 10-кратном увеличении ежедневно в течение семи дней. Храните мертвых личинок внутри стеклянной емкости для наблюдения за микозом и подтверждения эндопатогенной грибковой инфекции. Для биопроб отобранных энтомопатогенных грибов готовят три кондиальные суспензии конидиальных конвидов.

Прививайте суспензии в различные емкости для выращивания. Преобразуйте данные о смертности каждого штамма грибов с помощью арксинусного преобразования перед выполнением одностороннего ANOVA, чтобы определить значимые различия между методами лечения. Затем рассчитайте медианное летальное время и медианные значения летальной концентрации с помощью регрессионного анализа завещаний.

Отчетливо наблюдались морфологические характеристики стручковых трипсов на различных этапах жизни, включая раннюю личиночную стадию, позднюю личиночную стадию и взрослую стадию. Амплификация полимеразной цепной реакции, нацеленная на частичный ген COI, позволила получить полосу, подтверждающую идентичность трипсов, собранных в полевых условиях, как трипсов чили. Система выращивания листьев успешно поддерживала создание колонии чилийского трипса с 90% выживаемостью, наблюдаемой в контрольной группе в течение семидневного периода наблюдения.

Среди исследованных энтомопатогенных грибковых изолятов Cordyceps cateniannulata NCHU-213 вызвал наибольшую смертность среди личинок чили трипса через семь дней после инокуляции, за ним следует Cordyceps cateniannulata NCHU-298, в то время как Beauveria bassiana показала меньшую вирулентность. Значение LT50 от 10 до 8 конидий на миллилитр кордицепса cateniannulata NCHU-213 и Cordyceps cateniannulata NCHU-298 показало аналогичные значения и показало более короткие дни, чем Beauveria bassiana. Микоз был заметно замечен на трупах трипсов, инфицированных изолятами кордицепса, что было видно по грибковым наростам, покрывающим их тела.

Дозозависимое увеличение смертности было очевидно у трипсов, получавших Cordyceps cateniannulata NCHU-213 через четыре и пять дней после инокуляции, в то время как самая высокая смертность в 71,4% наблюдалась при 10 в степени 7 конидий на миллилитр через семь дней, за ней следовали 58,9% при 10 в степени 8 конидий на миллилитр и 44,4% при 10 в степени 6 конидий на миллилитр.