Ультразвуковая локализионная микроскопия для картирования микроциркуляторного русла головного мозга грызуна со сверхвысоким разрешением

Наши исследования направлены на характеристику микроваскулярной архитектуры и потока мозга, а также на совершенствование методов ультразвукового исследования с высоким разрешением. Недавние достижения оптимизировали отслеживание микропузырьков и укрепили процессуальные конвейеры для создания более стабильных протоколов для сверхразрешающего сосудистого картирования с помощью ULM. Для начала поместите анестезированную мышь на стереотаксичную раму с грелкой, установленной на 37 градусов Цельсия.

Используя твёрдое, но не повреждающее давление, зажмите носок или хвост, чтобы проверить отсутствие рефлексов и убедиться в достаточной глубине анестезии. Наносите глазную мазь на оба глаза для предотвращения язвы глаза и образования катаракты во время процедуры. Теперь побрийте голову мыши с помощью триммера.

Нанесите депиляционный крем. Дайте постоять максимум на 1–1,5 минуты, затем тщательно смойте тёплой водой и высушите марлей. Далее нанесите центрифугированный ультразвуковой гель на головку для обеспечения акустического соединения.

Для катетеризации хвостовой вены используйте инфузионный набор диаметром 27 gauge с половиной дюйма, соединённый с иглой 18 gauge полдюйма с восемью дюймовыми трубками. Укорачивайте трубку, если возможно, чтобы минимизировать мёртвый объём. Аккуратно поверните хвост животного на 90 градусов, чтобы обнажить боковые вены.

Затем закрепите хвост скотчем, чтобы сохранить стабильность и предотвратить движение во время катетеризации. Теперь определите вену на хвосте. Чтобы улучшить видимость вен, подогрейте хвост тёплой водой, чтобы способствовать вазодилатации.

С помощью пальца мягко надавите у основания хвоста и сдвиньте его к месту инъекции против направления кровотока. Вводите иглу параллельно вене с фаском вверх. Проверьте трубку на наличие флэшбэка крови, чтобы подтвердить правильное расположение иглы.

На системе визуализации запустите функциональное программное обеспечение для получения ультразвука и создайте новую сессию эксперимента. Отрегулируйте положение ультразвукового зонда. Теперь начните получение в реальном времени в программе и настройте датчик в реальном времени с помощью Power Doppler imaging для центрирования мозга на экране.

Оптимизируйте параметры изображения, такие как контраст и сжатие, для повышения качества визуализации. Затем откройте меню Angio 3D в программном обеспечении для приобретения. Настройте параметры сканирования так, чтобы полностью охватить мозг, затем начните получение сканирования.

Держите программное обеспечение для приобретения открытым, а после завершения Angio 3D запускайте IcoStudio для анализа и визуализации. Загрузите 3D-скан Angio для проверки. Перейдите к панели регистрации мозга и зарегистрируйте 3D-сканирование Ангио в полностью автоматическом или ручном режиме.

Сохраните завершённую регистрацию в формате BPS. Теперь откройте меню навигации «Мозг» и прокрутите вниз до панели менеджера Atlas. Используйте навигатор родительского и дочернего деревьев, чтобы просмотреть атлас мозга Аллена Мауса и выберите нужные анатомические области для наложения в панели трёх видов.

Выберите плоскость изображения, которая пересекается с выбранными интересующими областями. В корональном виде вручную разместите два маркера, чтобы определить желаемый срез для изображения. Затем нажмите на BPS Positioning, чтобы извлечь координаты двигателя для выбранной плоскости изображения.

Просмотрите предварительный просмотр изображения с 3D-сканирования Angio и нажмите «Скопировать координаты BPS». Переключитесь на программное обеспечение IcoScan и откройте панель зонда Move. Нажмите на «Нейронавигацию», вставьте скопированные значения и позвольте системе автоматически выровнять зонд с выбранной плоскостью изображения.

Затем начните живую съёмку, чтобы убедиться, что текущая плоскость съёмки совпадает с ранее выбранной плоскостью. Используя стерильный шприц, введите пять миллилитров раствора хлорида натрия 0,9% в микропузырьковый флакон ультразвукового контрастного агента через перегородку. Энергично перемешивать флакон в течение 20 секунд, чтобы микропузырьки снова суспензировали и обеспечить равномерное распределение.

Заранее определите параметры записи, включая последовательность ультразвукового звука, частоту кадров и общую продолжительность записи. Затем возьмите нужный объём микропузырьков для инъекции и начните сбор. После начала набора введите мышам 100 микролитров с использованием соответствующего разбавления.

Подтвердите усиление контраста на панели визуализации в реальном времени. Немедленно промыть оставшиеся микропузырьки в мертвом объёме, введя физиологическую жидкость в катетер. Дождитесь завершения приобретения и сохраните записанные данные.

Откройте программное обеспечение Icolab и нажмите на вкладку микроскопии локализации ультразвука. Затем нажмите на Compute ULM maps, чтобы начать процесс обработки. Выберите папку исходного источника, содержащую ранее полученные данные.

Затем выберите конкретный файл сканирования для обработки и измените границы времени обработки по мере необходимости. Нажмите на «Далее», чтобы перейти к этапу отчёта. Задайте путь выходной папки для сохранения обработанных файлов и настройте параметры визуализации для изображений отчета.

Теперь нажмите «Запустить», чтобы начать обработку данных. После завершения будет создан файл TRK, содержащий локализованные координаты микропузырьков, а также TIFF-файлы, представляющие плотность, скорость и обратно рассеянную амплитуду. Загрузите файл TRK в IcoStudio, чтобы начать изучать обработанные данные.

Затем используйте правую боковую панель IcoStudio для настройки параметров визуализации, таких как контраст, сжатие и цветовая карта для улучшения представления данных. Чтобы установить время интеграции, настройте двойной слайдер, расположенный внизу основного вида, чтобы определить начальный и конечный кадры анализа. Вкладка плотности показывает распределение появления микропузырьков.

Выбирайте между абсолютной плотностью и направленной плотностью. После этого нажмите на вкладку Velocity, чтобы показать скорость микропузырьков в миллиметрах в секунду с использованием абсолютного, направленного, осевого и бокового режимов. Регулируйте пороги контраста, сжатия и скорости для улучшения чёткости изображения.

Затем изучите вкладку «Обратно рассеянная амплитуда», чтобы увидеть отражательность микропузырьков, которая усиливает контраст и показывает микрососудистые структуры и движение вне плоскости. Экспортировать изображения в формате PNG высокого разрешения или генерировать TIFF-файлы для количественного анализа с настраиваемым размером пикселей. Карты плотности микропузырьков коронального среза мозга крысы, полученные с помощью ULM, разрешили как крупные сосуды, так и тонкие капиллярные структуры, выяв детальную сосудистую топологию, включая бифуркации и паттерны ветвления.

Карта скоростей того же среза мозга показала чёткий осевой направленный поток, при этом восходящий поток символизировал венозный дренаж, а нисходящий — артериальную перфузию, что соответствует известной структуре корковых сосудистых структур. Карта обратно рассеянной амплитуды обеспечивала контраст, зависящий от глубины, и выделяла сосуды на основе их положения высоты, что было полезно для сегментирования сосудов, находящихся вне плоскости или с низкой амплитудой. Карты плотности сосудистых сосудов, полученные с одной слабой точки различия у той же мыши, показали сильное пространственное перекрытие, подтверждая воспроизводимость корональной плоскости с помощью системы позиционирования мозга.

Количественный анализ левой соматосенсорной коры на протяжении сессий показал схожие распределения по радиусу сосуда, скорости и скорости потока, что подтверждает воспроизводимость измерений. Аналогичная воспроизводимость наблюдалась в области левого таламуса, с постоянными значениями радиуса сосуда, скорости и расхода между сессиями первой и второй недель. Эта работа доказывает, что микроскопия локализации ультразвука может надёжно создавать сверхразрешённые карты структуры и потока микрососудистых сосудов in vivo.

Этот протокол уполномочен необходимостью стандартизированной процедуры, позволяющей надёжно получать ULM у живых грызунов с помощью специализированной функциональной ультразвуковой системы.