Транзиентное оптическое очищение с использованием поглощающих молекул для визуализации ex vivo и in vivo

Это исследование направлено на оценку и внедрение очищения тканей с использованием поглощающих молекул в качестве неинвазивной стратегии для улучшения биомедицинской визуализации как в тканях ex vivo, так и у живых животных. Мы продемонстрировали, что пищевой краситель тартразин может быть использован для достижения быстрого и обратимого оптического очищения как в тканях, так и у живых животных, значительно увеличивая глубину и четкость изображения. Наш протокол устраняет критический пробел в воспроизводимости переходного оптического очищения путем наблюдения за молекулами и включает в себя передовые методы вычислительной визуализации для улучшения видимости элементов.

Предоставляя подробный протокол очистки тканей с помощью поглощающих молекул, наша работа помогает более широкому сообществу исследователей биологии и биомедицинской визуализации применять эти методы в своих собственных исследованиях. Наша лаборатория совершенствует эту технологию, исследуя физическое взаимодействие между светом и тканью, расширяя диапазон доступных материалов и разрабатывая оптимизированные платформы оптической визуализации. Для начала рассчитайте необходимую массу порошка красителя тартразина для приготовления нужного объема раствора.

Переложите рассчитанное количество порошка красителя в чистый стеклянный флакон. С помощью объемной пипетки добавьте в флакон необходимый объем деионизированной воды для поддержания точности. Если краситель не полностью растворяется при комнатной температуре, поместите стеклянный флакон в лабораторную печь, разогретую до 40 градусов Цельсия, на 10 минут или до полного растворения.

Затем ввергните раствор красителя в вихрь от 30 секунд до одной минуты, чтобы обеспечить полное растворение. Для ткани ex vivo разрежьте ткань куриной грудки до желаемой толщины в направлении, параллельном коллагеновым волокнам, и аккуратно промойте срезанную ткань водой. Поместите ткань между двумя чистыми предметными стеклами микроскопа, чтобы измерить толщину.

Аккуратно прижмите слайды друг к другу и используйте калибр нониуса, чтобы измерить расстояние в центре ткани. Далее замочите ткань в приготовленном растворе красителя. И поместите контейнер на орбитальный шейкер и встряхивайте со скоростью 100 оборотов в минуту в течение 10 минут.

Удалите ткань из раствора красителя с помощью чистых щипцов. Поместите образец между двумя прозрачными стеклянными предметными стеклами и сделайте снимки с помощью цифровой или научной камеры, настроенной на соответствующее разрешение и увеличение. Проводите процесс визуализации в условиях контролируемого освещения, чтобы свести к минимуму внешние световые помехи.

Чтобы измерить оптическое пропускание, поместите подготовленный образец в УФ-видимый спектрометр ближнего инфракрасного диапазона. Убедитесь, что система имеет правильную базовую основу и что световой луч проходит через одну и ту же область ткани до и после обработки раствором красителя для поддержания стабильности измерения. Для проведения процедуры поместите животное, находящееся под наркозом, на грелку, закаленную при температуре 37 градусов Цельсия.

С помощью машинок для стрижки мелких животных подстригите шерсть в нужной области изображения. Нанесите крем для депиляции на подстриженный участок менее чем на 60 секунд, чтобы удалить остатки волос и немедленно удалить крем. Очистите кожу с помощью спиртовых салфеток, чтобы предотвратить раздражение.

Чтобы подготовить установку для визуализации, подложите под животное грелку с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы предотвратить переохлаждение. Выровняйте источник света и камеру для получения высококачественных изображений. Для нанесения используйте 0,65 молярного раствора тартразина, смешанного с 0,3-0,4% агарозного геля.

С помощью пипетки нанесите приготовленный раствор на кожу, либо на живот, либо на голову, в зависимости от эксперимента. Дайте раствору постоять несколько секунд, чтобы начать впитываться. Теперь ватным тампоном аккуратно потрите область нанесения, чтобы равномерно распределить раствор и усилить впитывание через кожу.

Затем аккуратно помассируйте область чистым ватным тампоном и нанесите больше раствора по мере необходимости. Обратите внимание на появление оранжевых красных точек, которые будут постепенно сливаться в однородный цвет, свидетельствующий об успешном проникновении красителя и начале оптического очищения. Продолжайте массировать область, пока кожа не станет прозрачной и не станут видны внутренние органы, что обычно занимает от трех до пяти минут для небольшой области.

Аккуратно приложите к коже предметное стекло или защитную накладку, чтобы уменьшить блеск поверхности и свести к минимуму отражение. Аккуратно смойте раствор красителя с кожи с помощью ватного тампона или мягкой тряпочки, смоченной водой. Эффект оптического очищения обратится, и кожа постепенно вернется к своему первоначальному непрозрачному виду.

После отключения газовой анестезии дайте животному прийти в сознание. Как только животное полностью придет в себя и станет подвижным, верните его в домашнюю клетку. В необработанных тканях куриной грудки ex vivo основные закономерности не были видны, а данные спектрометра показали низкие значения пропускания, которые уменьшались с увеличением толщины ткани.

После обработки 0,65-молярным раствором тартразина ткани стали заметно прозрачными, а лежащие в основе сетки и логотипы стали четкими. Также наблюдалось существенное увеличение значений пропускания по всем толщинам видимого спектра. У живых мышей применение 0,65 молярного раствора тартразина позволило визуализировать внутренние органы через кожу в течение нескольких минут после лечения, показав заметно возросшую прозрачность в областях живота.

Оптическая очистка кожи головы позволила визуализировать кровеносные сосуды головного мозга без хирургического удаления кожи, продемонстрировав эффективность метода для визуализации мозга. Эффект очищения был полностью обратимым. Полоскание ткани водой восстановило помутнение и нормальный внешний вид кожи в течение нескольких часов, при этом рост волос наблюдался в течение нескольких дней.