Оптимизированная техника минимально инвазивной транссклеральной субретинальной инъекции мышам

Субретинальные инъекции являются важным инструментом для доклинических исследований методов лечения наследственных заболеваний сетчатки. В этом видео мы представляем оптимизированную минимально инвазивную технику субретинальной инъекции мышам. Транссклеральные субретинальные инъекции являются отличным способом доставки материала к фоторецепторам и СИЗД.

Однако этот метод является технически сложным и требует разработки оптимизированного протокола для повышения его воспроизводимости и доступности. Наши усовершенствования включают в себя разработку зеркала для век мыши, предоперационное введение атропина, создание точечной склеротомии с помощью алмазного ножа и оптимизацию размера иглы и инъекционного подхода. Мы надеемся, что последовательность, воспроизводимость, отличное покрытие трансдукции и минимальное хирургическое повреждение нашего метода улучшат доступность субретинальных инъекций для научного сообщества.

Наши оптимизации упрощают и ускоряют выполнение субретинальных инъекций мышам, снижают экспериментальную вариабельность и повышают показатели успешности инъекций. Этот метод облегчит будущие доклинические трансляционные исследования сетчатки. Для начала введите один миллиграмм на килограмм атропина внутрибрюшинно в общем объеме 50 микролитров за 30 минут до выполнения субретинальной инъекции.

Нагрузите стеклянную микроиглу нужным объемом раствора для инъекций. Прикрепите иглу к микроинжектору и установите компенсационное давление на пять гектопаскалей для противодействия капиллярному действию. Поместите мышь под наркозом под препарирующий стереомикроскоп.

Нанесите каплю 0,5% пропаракаина на глаз для достижения местной анестезии. Нанесите каплю смеси, содержащей 0,2% циклопентолата и 1% фенилэфрина, в глаз для расширения зрачка для послеоперационной визуализации субретинального пузыря и уменьшения интраоперационного кровотечения. С помощью изготовленного на заказ миниатюрного проволочного зеркала обнажите верхний свод и обездвижьте зеркало, чтобы обеспечить втягивание верхнего века без помощи рук.

Используя наклонные ножницы Ванны, сделайте пару лимбальных разрезов примерно на один миллиметр позади лимба в верхней конъюнктиве и капсуле Тенона, чтобы обнажить верхнюю склеру. Осторожно удалите остатки капсулы Тенона над местом инъекции. Теперь захватите передний край конъюнктивы и тенотомику с помощью фиксирующих зубчатых щипцов.

Затем аккуратно втяните шар, чтобы обнажить верхнюю склеру. Немедленно нанесите каплю сбалансированного буферного физиологического раствора на глаза, чтобы сохранить голые склеры увлажненными и добиться большего оптического увеличения. С помощью алмазного ножа сделайте точечную склеротомию примерно в положении «12 часов» и в одном-двух миллиметрах от лимба.

Расположите лезвие по касательной к склере, чтобы убедиться, что склеротомия маленькая и неглубокая. С помощью хирургической губки аккуратно удалите весь сбалансированный буферный физиологический раствор с поверхности глаза. Держите скос иглы вниз под небольшим углом к склере и медленно введите кончик в склеротомию, продвигаясь всего на 0,5-1 миллиметр, чтобы получить доступ к субретинальному пространству, не проникая в сетчатку.

Удерживая иглу неподвижно, начните инъекцию с углом 500 гектопаскалей с помощью ножной педали и поддерживайте непрерывное давление в течение 15 секунд. Извлеките иглу и наблюдайте за частичным рефлюксом введенного раствора через место склеротомии, что указывает на успешную доставку, поскольку субретинальное пространство не может вместить весь объем введенного раствора. Осторожно снимите фиксирующие щипцы и зеркало века, не оказывая давления на глазный яблоко, чтобы избежать дополнительного рефлюкса.

Сразу после инъекции нанесите на глаз обильное количество глазной мази-лубриканта, чтобы помочь визуализации субретинального пузыря. Субретинальный пузырь был четко виден на ОКТ сразу после транссклеральной инъекции, что подтвердило успешное родоразрешение. Для оценки пигментного эпителия сетчатки, или РПЭ, был введен дистрофин AAV-8 1-GFP, что привело к широкой зеленой флуоресценции по всему слою эпителия, что указывает на эффективную и широкую трансдукцию РПЭ с использованием транссклерального доступа.

AAV-8 родопсин GFP приводил к сильному зеленому флуоресцентному сигналу в палочковых фоторецепторах, видимому как на поперечных срезах, так и на глазном дне, что указывает на успешное нацеливание и экспрессию в фоторецепторных клетках. AAV8-CAG-mCherry произвел широкую красную флуоресценцию в слоях сетчатки, демонстрируя способность этого метода поддерживать генерализованную экспрессию трансгенов за пределами конкретных типов клеток. Вестерн-блоттинг лизатов сетчатки также показал сильную экспрессию зеленого флуоресцентного белка с самыми высокими уровнями, соответствующими центру инъекционного пузырька, подтверждая трансдукцию фоторецепторов с AAV8 родопсином GFP.

Оптимизация титра AAV с помощью иммунофлуоресцентного анализа срезов сетчатки позволяет выбрать титр вируса, который обеспечивает трансдукцию примерно 90% клеток-мишеней. Например, в этом случае разведение одного к 10 вирусного запаса родопсина GFP AAV8 привело к экспрессии трансгена почти во всех фоторецепторах. Напротив, разведение 1 к 100 приводило к недостаточной скорости трансдукции.

Электроретинограмма показала, что транссклеральные инъекции сохраняют нормальную функцию сетчатки, в то время как трансретинальные инъекции приводят к значительному снижению откликов на зубцы А и В, что указывает на повреждение сетчатки.