Одновременная безметочная автофлуоресцентная мультигармоническая микроскопия

Одновременная безметочная автофлуоресцентная мультигармоническая микроскопия, или микроскопия SLAM, позволяет получать уникальную информацию в биологических образцах путем измерения нелинейных взаимодействий со светом. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения жизни и болезней в микроскопическом масштабе. Мы наблюдаем сдвиг в сторону мультимодальной визуализации без меток, предлагающей более глубокое понимание клеточных и тканевых структур и динамики, избегая при этом токсичности и обеспечивая взаимодополняющие контрасты и корреляции между модальностями.

Современные нелинейные микроскопы без меток регистрируют по одному сигналу за раз, что может привести к смещению, повреждению фотографий и множеству параллельных процессов. SLAM решает эти проблемы, обеспечивая строго корегистрируемый мультимодальный контраст, обеспечивая надежные пространственные и временные данные. Этот метод позволяет одновременно возбуждать и регистрировать четыре канала в многофотонном микроскопе.

Использование фотонного кристаллического волокна для расширения импульсов для ГВГ, ТНГ и двух- и трехфотонной флуоресценции. SLAM захватывает мультиплексную метаболическую структурную и динамическую сигнальную информацию клеток без артефактов выравнивания или экзогенных меток, что позволяет проводить стандартизированный количественный анализ тканей. Его приложения охватывают фундаментальную биологию, трансляционные исследования и открытие биомаркеров в онкологии, нейродегенерации и регенерации тканей.

Для начала используйте спектрометр или оптический анализатор спектра, чтобы измерить лазер после параболического зеркала и проверить генерацию суперконтинуума фотонного кристаллического волокна. Поверните промежуточную пластину после поляризационного светоделителя, чтобы оптимизировать ширину суперконтинуума. Включите автокоррелятор микроскопии.

В программном обеспечении установите детектор на внутренний детектор и отрегулируйте диапазон сканирования на 5 пикосекунд, чтобы захватить полную ширину автокорреляции импульсов. Разблокируйте лазер и направьте автокоррелятор по лучу, выходящему из формирователя импульсов, до тех пор, пока не появится сигнал. Убедитесь, что шторка 2 закрыта.

Затем нанесите на линзу объектива соответствующую иммерсионную среду, например воду или масло. Поместите внешний детектор автокоррелятора на предметный столик микроскопа и расположите его непосредственно над объективом. Теперь включите сканирующие зеркала гальванометра, чтобы установить их напряжение равным 0.

Откройте затвор и с помощью флуоресцентной мишени подтвердите, что луч достигает внешнего детектора. Установите детектор автокоррелятора в качестве внешнего детектора. Затем отрегулируйте положение рабочей области до появления сигнала.

Настройте полиномиальные коэффициенты формирователя импульсов для итеративной минимизации длительности импульса, измеренной автокоррелятором. По мере уменьшения длительности импульса соответственно уменьшайте дальность сканирования, чтобы повысить точность и визуализацию автокорреляционной функции. Убедитесь, что вход лазера на фотонное кристаллическое волокно заблокирован, и включите лазер.

Дайте лазеру прогреться в течение 30 минут. Убедитесь, что на пути луча нет препятствий, затем поместите измеритель оптической мощности на пути луча непосредственно перед фотонным кристаллическим волокном. Нажмите кнопку Control, чтобы открыть затвор 1 и измерить входную мощность.

Снова закройте затвор 1. Переместите измеритель мощности на выход фотонного кристаллического волокна после параболического зеркала. Откройте затвор 1 и используйте входной трехосевой столик для максимизации выходной мощности.

Дайте фотонному кристаллическому волокну прогреться в течение 10 минут, затем снова максимизируйте выходную мощность, используя трехосевой каскад, и запишите передачу PCF. Переместите измеритель мощности за нейтральным фильтром и поверните фильтр, чтобы отрегулировать мощность лазера, достигающего образца. Умножьте измеренную мощность на коэффициент пропускания остальной оптики, чтобы определить мощность образца.

Теперь включаем гальванометры и выступаем на сцене. Запустите программное обеспечение для сбора данных и введите желаемые параметры изображения. Поместите образец на столик с помощью того же иммерсионного носителя, который ранее был нанесен на линзу объектива.

Затем выключите свет в комнате и закройте шторы, чтобы предотвратить попадание окружающего света. Далее включите на детекторе блоки питания и усилители. Закройте световой короб, окружающий предметный столик микроскопа.

С помощью электронных переключателей управления вручную откройте шторки датчика 3-6. В программном обеспечении для сбора данных нажмите кнопку «Нажмите, чтобы начать сбор данных», чтобы начать создание изображений SLAM. Отрегулируйте фокусировку микроскопа с помощью ручки контроллера предметного столика до тех пор, пока образец не станет хорошо виден.

Используйте джойстик на контроллере предметного столика микроскопа, чтобы найти нужное поле зрения. После этого нажмите «Стоп и сброс». На вкладке Сохранение установите переключатель Сохранить данные в положение Да.

Затем нажмите на опцию «Нажмите, чтобы начать съемку» и дождитесь завершения съемки. Чтобы манипулировать образцом во время визуализации, закройте шторки детектора и используйте фонарик или налобный фонарь для освещения. После корректировки вернитесь к настройке изображения.

Чтобы завершить съемку, закройте жалюзи датчиков, выключите датчики и только после этого включайте свет в комнате. Заблокируйте лазер с помощью затвора 1, затем выключите лазер. Выключите гальванометры и сцену и закройте программное обеспечение для сбора данных.

Утилизируйте образец ткани надлежащим образом и очистите рабочую станцию. Правильно расщепленное фотонное кристаллическое волокно показало плоскую концевую грань, перпендикулярную его оси, и чистую грань. Плохо расщепленные фотонные кристаллические волокна имели скошенные надрезы, сколы на гранях и выраженные царапины или мусор на поверхности.

Неправильное обращение или загрязнение привели к появлению видимой грязи и скопления твердых частиц вокруг поверхности волокна, скрывающих рисунок воздушного отверстия. Обожженное ядро с затемненными областями указывало на повреждение фотонного кристаллического волокна в конце его срока службы. Спектр суперконтинуума охватывал примерно 975-1, 175 нанометров с плоской вершиной и отчетливыми спектральными модуляциями.

Автокорреляция импульсов после сжатия показала симметричный профиль с узким полноширинным полумаксимумом, что указывает на хорошее формирование импульса. Правильно функционирующие источники суперконтинуума выдавали сильные сигналы второй и третьей гармоник. Суженный суперконтинуум приводил к потере интенсивности сигнала третьей гармоники при сохранении сигнала второй гармоники.

Отсутствие формирования импульсов резко снижало все нелинейные сигналы, что приводило к получению слабого и малоконтрастного изображения. Успешная визуализация почечной ткани ex vivo показала отчетливые структуры нефрона с множественными сильными оптическими сигналами, включая генерацию третьей гармоники и флуоресценцию NADPH. Почечные интерстициальные коллагеновые волокна были идентифицированы с помощью сильных сигналов генерации второй гармоники.

Изображение окислительно-восстановительного коэффициента показало повышенный аэробный митохондриальный метаболизм в проксимальных канальцах почечной коры по сравнению с мозговым веществом. Вторая карта окислительно-восстановительного соотношения подтвердила пространственные колебания в окислительном и гликолитическом метаболизме, усиливая дифференциальное использование энергии в ткани.