Микробиореакторное производство мезенхимальных стромальных клеток, зависящих от анкеража, подготовленных к острому респираторному дистресс-синдрому

Мы изучаем, как клетки взаимодействуют с окружающей средой, в том числе при производстве или производстве клеток в качестве терапии. Здесь мы рассматриваем вопросы о том, как клетки, зависящие от якоря, такие как МСК, мезенхимальная строма или стволовые клетки, могут быть получены для преодоления некоторых барьеров для клинической трансляции. Растущее осознание того, что вариабельность популяции клеток влияет как на консистенцию, так и на силу конечного продукта клетки для каждой партии или человека.

Эти проблемы могут даже повлиять на регуляторное одобрение некоторых клеточных терапий. Мы нацелены на зазор, который позволяет получить большое количество клеток на миллилитр жидкости при высоком контроле окружающей среды и в масштабе. Этот протокол позволяет включать встроенный мониторинг окружающей среды для клеток, зависящих от анкерирования, таких как МСК.

Этот процессный контроль — преимущество по сравнению с колбами, которые до сих пор используются в большинстве лабораторных и клинических производств. Существует несколько открытых вопросов для MSC и других типов клеток, чувствительных к механическим сигналам. Например, как такой подход может помочь создавать клетки для решения других заболеваний?

Для начала снимите прозрачную пластиковую крышку, соединённую с бутылкой LL в полке. Используя новый стерильный 50-миллилитровый шприц без поршня, соедините сопло с бутылкой LL. Налейте стерильную фильтрованную воду в ствол шприца и введите её в бутылку LL. Аналогично, наполните бутылку L 25 миллилитрами низкоглюкозного DMEM без FBS, бутылку R — 25 миллилитрами стерильного PBS, а бутылку RR — восемью миллилитрами раствора для промывания против прилизания. Повторите процедуру, чтобы подготовить необходимое количество расходников для эксперимента.

Далее проведите самотестирование каждой капсулы, которая будет использована в эксперименте. После того как капсула успешно прошёл все проверки самотеста, снимите кассеты для самотестирования и положите их в светозащищённые мешки для хранения. Подключите расходный материал к биореактору.

Снимите зелёную ленту с расходных клапанов и установите расходник в контейнер. Установите зажимы и проверьте наличие шипящего звука, чтобы убедиться в надёжном уплотнении. Соедините белую линию датчика давления, красную трубку давления воздуха и синюю вакуумную линию между расходным материалом и базовой станцией или контейнером.

Перед началом нового эксперимента убедитесь, что боковой инъекционный отверстие закрыт белым каплей-зажимом. Нажмите на значок Flush Bottles в программном интерфейсе. Включите кнопку радио для бутылки L, выберите «Вывод в отходы», затем нажмите «Запустить промывку MSCserum».

В окне «Содержимое бутылки» указывайте, что MSCserum находится в бутылке R, которая содержит PBS. Затем перейдите в раздел Manual Ops и выполните три цикла Eject Wash на бутылке с отходами. В окне «Содержимое бутылки» указано, что MSCserum теперь находится в бутылке RR, которая содержит раствор для промывания против прилипления.

Вернитесь к Manual Ops и выполните один цикл Eject Wash на бутылке с отходами. Через 30 минут прополосните расходник с помощью PBS. Опустошите реактор, чтобы дождаться введения клетки и микроносителя.

В панели Manual Ops нажмите Reinoculate. Оставьте систему на паузе на этапе, где на панели появляется запрос на имокуляцию реактора. Далее пипетка вычисляет рассчитанный объём суспензированных клеток в 15-миллилитровую коническую трубку с микроносителями для каждого состояния.

Добавьте в каждую трубку от 2,2 до 2,5 миллилитров свежими, тёплыми человеческими мезенхимическими стволовыми клетками. Работая с одним-двумя расходниками одновременно, убирайте их с базовой станции и относите в шкаф биобезопасности. Убрате смесь клетки и микроносителя в пятимиллилитровый шприц с помощью зелёной тупой иголки диаметром 4 дюйма.

Введите смесь в реактор. Держите кабель порта впрыска у основания кассеты, стараясь не отсоединить трубу. Используя движение между большим и указательным пальцами, покрутите линию порта инъекции на два полных оборота, чтобы создать узловый изгиб на линии.

Заправьте узел в отверстие у основания порта инъекции и закрепите его маленьким кусочком лабораторной ленты. Затем верните расходник на базовую станцию. После повторения инъекции для всех расходных материалов пройдите по программному интерфейсу, чтобы показать, что вакцинация завершена.

Когда программа возвращается на главную страницу, удалите белый зажим с выходных линий расходных материалов. Входите в Manual Ops и выполняйте функцию Eject Excess с выходным портом, установленным в P для перфузии. Включите режим статического микширования с циклом 1 680 секунд включённым и выключенным 120 секундами, установите частоту микширования на пять герц.

Чтобы начать сбор клеток, используйте шприц объёмом 1 миллилитр, чтобы набрать 200 микролитров Проназа и примерно 300–400 микролитров воздуха. Открутите крышку на боковой инжекторной линии и распылите 70% этанолом на разъём безигольного клапана. Снимите ленту с линии инжекции с узловой стороны порта, развяжите узел и снимите белый зажим в виде слёзы.

Теперь подключите шприц объёмом один миллилитр и аккуратно введите Pronase в реактор. Прогоняйте жидкость воздухом, чтобы обеспечить полную доставку. Снова включите зажим в виде слёзы и заново закройте инъекционную линию впрыски.

Затем верните расходник в контейнер, подключите все линии, снимите белый C-образный зажим и возобновите смешивание. Поставьте бутылку с отходами и бутылку с источником медиа на лёд. Запустите пятиминутный таймер и дайте Pronase переварить микроносители в реакторе.

Через пять минут проверьте, что микроносители деградировали, проверив их отсутствие в реакторе. Собирайте ячейки, введя Manual Ops, установите количество циклов на три, выберите Output Port W для отходов и нажмите Eject Wash. После завершения циклов Eject Wash перенесите расходник в шкаф с биобезопасностью.

Затем вытащите содержимое бутылки с помощью шприца на 10 или 20 миллилитров. Раздайте содержимое бутылки с отходами в 15-миллилитровую коническую центрифугную трубку. Центрифугуйте клетки при 300 г в течение пяти минут.

Аспирируйте супернатант и оцените размер клеточной гранулы. Экологические условия, включая pH, температуру, растворённый кислород и углекислый газ, стабильно поддерживались на протяжении 10-дневного периода культурирования в системе микробиореактора. Вариация pH в микробиореакторе была значительно ниже по сравнению с состоянием полистироловой колбы в культуре тканей.

Выход клеток был выше в микробиореакторе, чем в колбе T25, при сохранении аналогичной жизнеспособности клетки. Из 14 измеренных критических характеристик, связанных с потенцией, девять показали значительно более высокую экспрессию мРНК в условиях микробиореактора по сравнению с колбой T75.