Изучение белково-гликановых взаимодействий: достижения в области ядерного магнитного резонанса

Мы изучаем белок-белковые и белок-гликановые взаимодействия, уделяя особое внимание комплексу интегрин-дезинтегрин. Наша модель исследует структурную динамику и подчеркивает роль поверхностной силы в посредничестве в формировании комплекса и стабильности взаимодействия. Наша группа занимается изучением роли поверхностных сил в молекулярном распознавании и эволюции сайтов связывания путем изучения поверхностных гидрофобных кластеров, присутствующих в белках.

Решение ЯМР позволяет обнаруживать взаимодействия белков. Хотя слабые взаимодействия необходимы для жизни, существует склонность к высокоаффинным комплексам, хотя они присутствуют во многих важных биологических функциях. Наша группа сосредоточена на использовании подходов интегративной структурной биологии для изучения больших белковых комплексов.

Мы используем ЯМР в качестве основного инструмента для изучения динамики и функциональных аспектов. Для начала приготовьте четырехмиллимолярный раствор D-маннозы в буфере фосфата натрия при pH 7,4 с 50 миллимолярами хлорида натрия и 5% оксида дейтерия. Разделите раствор на два образца, один из которых содержит 80 микромолярных ЦВН, а второй без.

Для картирования связывания лиганда через возмущение химического сдвига на ЯМР-спектрометре настройте последовательность импульсов HSQCTOPSI для регистрации H1C13 HSQC. Настройте временную область, спектральную ширину, несущую частоту и количество сканирований. Рассчитайте возмущение химического сдвига с помощью приведенного уравнения.

Чтобы отобразить связывание лиганда через разницу переноса насыщения, сначала создайте новый набор данных. Настройте параметры для экспериментов ЯМР ЗППП, либо отсеяв различные частоты насыщения, либо зафиксировав частоту при изменении времени насыщения для оценки накопления. Настройка экспериментов 1D H1 NMR с использованием последовательности импульсов ZGPR.

Настройте спектрометр на H1, выполните шимминг и измерьте жесткий пульс на 90 градусов. Центрируйте несущую частоту примерно на уровне 4,7 частей на миллион, что соответствует сигналу воды, затем выберите STDDIFFESGP. 3 последовательности импульсов и задайте параметры захвата.

Установите необходимую спектральную ширину, задержку между развертками D1 до четырех секунд и определите время насыщения D20 в соответствии с целями эксперимента. Загрузите список FQ2 с частотой вне резонанса при минус 40 частей на миллион и частотами на резонансе только для насыщения белка. Проверьте резонансные частоты минус 0,59, 0,73 и 8,1 частей на миллион, чтобы определить оптимальные условия.

Используйте оптимальную частоту для получения спектров STD при временах насыщения 0,5, один, 1,5, два, 2,5, три и четыре секунды. Построение графика соответствующих значений ASTD в зависимости от времени насыщения. Теперь установите количество сканирований равным 64 и усредните цикл эксперимента четыре раза.

Затем подсчитайте общее количество сканирований. Установите задержку между сканированиями равной четырем секундам и время сбора данных равной 2,7262976 секунды. Настройте импульс насыщения, установив длительность 50 миллисекунд и управляя формой Гаусса с помощью фигурной программы 9SP9.

Примените фильтр строк T1 в варианте ЯМР STD, затем установите время блокировки спина D29 в зависимости от размера белка. Чтобы отобразить связывание лиганда H1 R2, сначала выберите программу CPMG_ESGP2D импульсов из стандартной библиотеки Bruker. Задайте эксперимент в качестве 2D-сбора.

Настройте параметры сбора данных, как показано на рисунке. Затем проведите эксперимент в течение 200 циклов по восемь сканирований в каждом. Настройте список счетчиков переменных в соответствии с желаемым общим временем цикла CPMG.

Проведите два эксперимента, один для образца с белком, а другой для образца, содержащего только лиганд. Постройте график спектров H1 для каждого TCPMG с помощью команды EFP или синуса M, за которым следует FP, затем настройте функцию окна в соответствии с наилучшей стратегией обработки. Рассчитайте коэффициент Q, используя уравнение.

Получите H1N15HSQC спектры CVN, меченного N15, при температуре 298 Кельвинов. Титруйте D-маннозой до достижения конечных концентраций ноль, один, два, пять, 10, 20, 40 и 60 миллимоль. Используйте фазочувствительную FHSQCF3GPPH быструю последовательность импульсов HSQC из стандартной библиотеки Bruker.

Затем рассчитайте возмущение химического сдвига по формуле. Построите график значений CSP для каждого остатка в зависимости от концентрации D-маннозы, чтобы определить константу диссоциации KD с использованием уравнения пять. Затем подогнайте полученные данные под одну изотерму связывания по формуле.

Используйте фазочувствительную последовательность импульсов HSQCT2ETF3GPSI3D и настройте параметры, как показано на рисунке, для измерения значений N15 R2 отдельных остатков CVN при отсутствии и присутствии 60 миллимолярной D-маннозы при 298 Кельвинах. Обрабатывайте псевдотрехмерные спектры с помощью NMRPipe для создания HSQC-подобных спектров для каждой задержки релаксации. Импортируйте обработанные спектры в платформу анализа.

Затем выделите все спектры и примените инструмент «Следить за изменениями интенсивности». Построите график интенсивности каждого перекрестного пика как функции ослабления T и подгоньте распад к моноэкспоненциальной функции, чтобы извлечь значения N15 R2 для каждого остатка. Рассчитайте экспериментальную погрешность по отношению сигнал/шум HSQC-подобных спектров за 67,84 миллисекунды.

Обработайте область спектра, содержащую только шум, и преобразуйте его в текстовый файл с помощью данной команды. Затем определите стандартное отклонение области шума или интенсивность шума с помощью статистического программного обеспечения. Вычислите экспериментальную погрешность с помощью заданного уравнения.

Химические сдвиги наблюдались для обеих аномерных форм D-маннозы в присутствии CVN, при этом большие сдвиги наблюдались в бета-D-маннозе, что указывает на предпочтительное связывание. Для большинства водородов D-маннозы в присутствии CVN наблюдались два отчетливых пика, соответствующих свободному и связанному состояниям. Ядра водорода, демонстрирующие самые высокие значения ASDD, были связаны с бета-D-маннозой, что согласуется с сильными биполярными взаимодействиями с CVN.

В анализе скорости поперечной релаксации H beta 4 был единственным протоном, который продемонстрировал заметное увеличение релаксации при связывании с CVN. Возмущения химического сдвига H1 и N15, вызванные добавлением лиганда, были самыми высокими при концентрации до 10 миллимоляров. Остатки I40, E41, N42, V43, D44 и G45 в бета-цепи показали значительные химические возмущения сдвига, что указывает на то, что они являются высокоаффинным сайтом связывания для D-маннозы.

Изотермы связывания показали, что остаток D44 имеет самое высокое сродство среди остатков бета-цепи, с константой диссоциации примерно в один миллимоляр. Измерение скоростей релаксации N15 R2 показало как увеличение, так и уменьшение значений дельта R2 при связывании D-маннозы, что свидетельствует о сочетании конформационных процессов стабилизации и обмена. Остатки C58, R59, K74 и R76 продемонстрировали повышенные значения дельты R2, что подтверждает их участие в сайте связывания с высоким сродством, в то время как остатки F4, C8, R24 и G27 представляли область с низким сродством.