Улучшенное редактирование генома с помощью метода электропорации in vivo на основе доставки нуклеиновых кислот яйцевода для генерации мышей с нокаутом

Цель нашего исследования — упростить создание нокаутируемых мышей с помощью электропорации в утробе, доставки компонентов редактирования генома непосредственно в яйцеводы беременных самок. Микроинъекции в зиготы требуют содержания большого количества животных, включая самок донора и реципиента, а также вазэктомированных самцов. Поэтому предпочтительнее использовать протоколы, минимизирующие использование животных.

Использование системы Nepa21 для электропорации зигот предоставляет уникальную возможность генерировать мышей с нокаутированием генов в один шаг, с эффективностью, сопоставимой со стандартными методами ядерной инъекции. Для начала используйте инструменты вычислительного анализа для выявления потенциальных последовательностей однонаправленной РНК, направленных на выбранный интересующий ген. Выберите последовательности, расположенные в экзонах, максимально близких к желаемому месту мутации. Используйте браузер генома для перекрёстного сравнения структуры экзомов и приоритизирования последовательностей, присутствующих в большинстве изоформ сплайса.

Проанализируйте предсказанную внецельную активность каждой последовательности направляющих с помощью интегрированной системы оценки инструмента. Выбирайте последовательности, демонстрирующие наименьшую вероятность нецелевого связывания. Для получения линейного двухцепочечного ДНК-шаблона подготовьте мастер-смесь ПЦР с использованием компонентов, указанных в данной таблице.

Добавьте полимеразу напоследок и держите мастер-смесь на льду для сохранения ферментативной стабильности. Затем проведите ПЦР с использованием следующих термических циклических условий. Далее подготовьте мастер-смесь транскрипции in vitro с использованием указанных компонентов и инкубуйте реакцию в течение 1,5 часов при 37 градусах Цельсия с помощью термоциклера для стабильного контроля температуры.

Затем добавьте два микролитра ДНКазы I в реакцию. Инкубировать при 37 градусах Цельсия ещё 30 минут, чтобы переварить шаблон ДНК, а затем инактивировать фермент при 75 градусах Цельсия в течение пяти минут. После очистки РНК TRIzol измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и проверьте соотношения A260 к A280 и A260 к A230.

Для подготовки рибонуклеопротеинового комплекса к трансфекции разведите один молярный буфер Tris-HCl до концентрации 100 миллимоляров с использованием воды без нуклеазы. Фильтруйте раствор с помощью шприцового фильтра с размером поры 0,022 микрометра. Разбейте по 10 микролитровым порциям и храните при 4 градусах Цельсия до использования.

Далее подготовьте смесь трансфекции с использованием нуклеазы spCas9, однопроводной РНК и Tris-HCl, разбавленных водой DEPC в трубке без нуклеаз. Инкубировать смесь трансфекции при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы образоваться рибонуклеопротеиновый комплекс. Затем аликвот смеси трансфекции разбить на небольшие объёмы, подходящие для отдельных сессий I-GONAD, и поддерживать её на четырёх градусах Цельсия для сохранения активности реагентов.

После спаривания самок мышей CD1 с одноразовыми самцами CD1 за ночь проверьте у каждой самки наличие копуляционной пробки. Переместите только тех самок с видимыми пробками в новую клетку для дальнейших экспериментальных процедур. Автоклавуйте все хирургические инструменты из нержавеющей стали для обеспечения стерильности перед использованием.

Затем взвесьте выбранные заглушки=положительные самки мышей с помощью электронных весов перед анестезией. Следите за анестезией мышей на предмет потери рефлекса сжатия пальца ног, чтобы подтвердить адекватную анестезию. Положите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела во время процедуры.

Затем нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. С помощью тонких ножниц сделайте продольный разрез шириной 0,7 сантиметра на коже нижней части спины. Затем раздвините слегка открытые кончики ножниц вбок, чтобы аккуратно удлинить кожный разрез примерно до 1,3 сантиметра.

После этого аккуратно сделайте разрез на брюшину шириной 0,7 сантиметра, чтобы открыть брюшную полость. Удлините брюшный разрез до 1,1 сантиметра, нажимая с обеих сторон слегка открытыми кончиками ножниц. Найдите жировую подушечку, соединённую с яичником, и аккуратно вытяните её наружу с помощью щипцов, пока не окажутся яичник, яйцевод и матка.

С помощью сосудового зажима закрепите жировую подушечку для стабилизации репродуктивных структур. Затем загрузите два микролитра смеси для инъекции рибонуклеопротеинов в одноразовый пластиковый капилляр с помощью стриппер-пипетки. С помощью микроножниц сделайте разрез диаметром 0,2 сантиметра в стенке яйцевода в нескольких миллиметрах выше ампулы.

Вставьте пластиковый капилляр, прикреплённый к стрипперной пипетке, в разрез яйцепровода и аккуратно выведите инъекционную смесь, не вводя воздух. Аккуратно вынимите пластиковый капилляр из яйцепровода, чтобы завершить инъекцию. Включите электропоратор, нажав на передней панели питания.

Установите параметры электропорации на устройстве так, как показано на экране. С помощью электродов типа пинцета аккуратно захватите яйцевод и нажмите кнопку Kiloohm для измерения сопротивления. Сразу после измерения сопротивления нажмите кнопку Start, чтобы начать электропорацию, и дождитесь, пока на кнопке Ома появится сигнал окончания.

После электропорации первого яйцевода аккуратно возвращайте репродуктивный тракт в брюшную полость. Закройте разрез хирургическим швом 4-0 полигликолевой кислоты. Для генотипирования разработайте 18–21 нуклеотидный длинный праймер с температурой плавления около 60 градусов Цельсия, чтобы получить продукт ПЦР с парой оснований 300–600.

Чтобы подтвердить специфичность каждого праймера, выполните поиск BLAST по базе данных генома мыши, чтобы устранить риск неспецифической амплификации. Далее для извлечения ДНК с помощью ушейного удара возьмите небольшой образец ткани размером примерно два миллиметра из уха мыши. Добавьте 100 микролитров лизис-буфера.

Инкубировать образец при 95 градусах Цельсия в течение 60 минут, создавая вихрь каждые 20 минут для эффективного лизиса. После проведения секвенирования Сэнгера проанализируйте результаты для оценки результатов редактирования генома. Для использования анализа ICE загрузите оба секвенирных файла Сэнгера, введите последовательность направляющей РНК и выберите подходящую нуклеазу для эксперимента CRISPR.

Далее, чтобы использовать TIDE, загрузите контрольные и экспериментальные секвенирующие файлы в формате AB1 и введите последовательность направляющей РНК. Анализ ICE выявил три различных варианта indel в участке разреза Cas9: удаление одной пары оснований в 42% последовательностей, удаление трёх пар оснований в 25% последовательностей и удаление 23 пар оснований в 27% последовательностей. Значение соответствия модели составило 0,94, а балл нокаутирования — 69, что указывает на сильную предсказанную корреляцию и вероятный генный вынос.

Хроматограммы последовательности подтвердили нарушение в месте разреза Cas9 в отредактированном образце, тогда как контрольная хроматограмма показала целостность последовательности в том же месте. Из шести электропорированных мышей только четыре вывели щенков с мутациями, что дало 60% общей эффективности редактирования. Все помёты шести электропорированных мышей показали снижение числа щенков — всего три-четыре щенка на мышь.