Совершенствование технологии химерных антигенных рецепторов-внеклеточных везикул (CAR-EV): будущее терапии рака

Наши исследования сосредоточены на развитии диагностики и терапии на основе экзосом. Цель состоит в том, чтобы разработать препараты на основе экзосом химерных антигенных рецепторов, которые являются более безопасными, эффективными и доступными, чем клеточная терапия, для лечения побочных опухолей. Наши платформы EXO-NET и EXO-ACE обеспечивают масштабируемое, воспроизводимое и соответствующее требованиям GMP выделение экзосом с высокой производительностью и чистотой, устраняя ограничения традиционных методов исследований и терапии.

EXO_NET net и EXO-ACE обеспечивают быструю, масштабируемую и соответствующую требованиям GMP изоляцию электромобилей с превосходной чистотой и воспроизводимостью, превосходящую центрифугирование и осаждение для исследований, диагностики и терапевтических применений. Мы разработали быстрый, масштабируемый и проверенный метод создания CAR-EV и создания бесклеточных, таргетных терапевтических средств нового поколения. Это обеспечивает надежный рабочий процесс, который может быть применен при других заболеваниях, где есть клиническая необходимость.

Наша следующая цель — использовать методы, которые мы разработали и проверили, для создания CAR-EV для доставки РНК-терапевтических средств для лечения солидных опухолей и других воспалительных заболеваний. Для начала доведите ионообменную колонну до комнатной температуры, дав ей постоять в вертикальном положении в течение 15 минут. С помощью пипетки добавьте 10 колонок в буфер регенерации, а затем 10 в столбик в буфер для выравнивания.

Пропустите кондиционированную среду THOD через полиэфирсульфоновый фильтр толщиной 0,22 микрометра. Теперь добавьте до 31,2 объема столбца отфильтрованной выборки в уравновешенный столбец. Затем добавьте 10 колонок промывочного буфера, а затем 2,5 столбца объема элюирующего буфера.

Соберите поток через содержащее обогащенные внеклеточные пузырьки. Используя ультрафильтрационные центробежные фильтры мощностью 30 килодальтон и разбавитель, проводят буферный обмен на элюировании внеклеточных везикул, обеспечивая минимальное 100-кратное разбавление. Отрегулируйте окончательный объем заменяемого раствора в зависимости от экспериментальных потребностей.

Пропустите образец обогащенной внеклеточной везикулы через фильтр 0,22 микрометра, чтобы стерилизовать его для анализа in vitro. Определение распределения по размерам, концентрации и выхода внеклеточных везикул CAR с помощью анализа слежения за наночастицами. Для выделения внеклеточных везикул с высокой пропускной способностью панэкзосомы включите прибор и войдите в систему.

Настройте параметры для установки протокола выделения белка HT EV. Подготовьте гребневую пластину, поместив ее в 96-луночную глубокую пластину. Добавьте по одному миллилитру PBS в каждую лунку, чтобы приготовить три моющие пластины.

Теперь приготовьте элюирующую пластину, пипетируя 35 микролитров 1%-ного буфера SDS в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем приготовьте связующую пластину, добавив один миллилитр кондиционированной среды. В автоматизированной системе изоляции начните протокол, выбрав программу HT EV Protein Isolation Protocol, и нажмите кнопку воспроизведения.

Откройте прибор, чтобы начать загрузку пластин. Следуйте инструкциям прибора и загрузите в инструмент подготовленные элюирующие пластины, а затем глубоко луночные пластины для трех промывок. Непосредственно перед загрузкой связующей пластины добавьте в каждую лунку по 30 микролитров шариков захвата панэкзосом.

Загрузите связующую пластину в инструмент, затем загрузите гребневую пластину с наконечником и закройте инструмент, чтобы начать привязку. Система будет смешивать образец кондиционированной среды и магнитные шарики непрерывно на медленной скорости в течение 30 минут, способствуя эффективному захвату внеклеточных везикул. По завершении этапа связывания позвольте системе выполнить три этапа стирки, перемешивая на медленной скорости в течение 30 секунд для удаления неспецифических загрязнений.

Позвольте автоматизированной системе инициировать лизис внеклеточных везикул для восстановления белка, выполнив 30-секундное донное перемешивание. Во время инкубации прибор делает паузу на семь минут и 30 секунд, при этом наконечники пипеток располагаются над каждой лункой. Начните еще один 30=секундный микс, за которым последует еще одна пауза в семь минут и 30 секунд.

Когда протокол завершится, система поднимет использованный гребень наконечника, оставив раствор в 96-луночном планшете и магнитных шариках, прикрепленных к наконечникам. Наконец, инструмент перейдет к этапу выхода, возвращая расческу с кончиком в пластину расчески для наконечника. Откройте прибор и снимите пластины.

Флуоресценция GFP подтвердила экспрессию CAR в трансдуцированных Т-клетках, при этом локализация была очевидна в клеточных кластерах, а колокализация была подтверждена наложением светлых и GFP-каналов. Анализ с отслеживанием наночастиц показал значительно более высокую концентрацию внеклеточных везикул в обогащенной фракции EV по сравнению с кондиционированными средами для конструкций EGFR и HER2 CAR. Вестерн-блоттинг подтвердил наличие гранзима B в CAR-экспрессирующих клетках и в изолированных внеклеточных везикулах, при этом кальнексин отсутствовал во внеклеточных везикулах, что указывает на отсутствие клеточной контаминации.

Внеклеточные везикулы CAR, нацеленные на EGFR, значительно снижали жизнеспособность клеток рака молочной железы MCF-7 на 70% и жизнеспособность клеток рака крови K-562 на 40%. Внеклеточные везикулы CAR, нацеленные на HER2, показали снижение жизнеспособности клеток рака молочной железы MCF-7 примерно на 10%, при этом не оказывая заметного влияния на клетки рака крови K-562.