Поддающееся лечению in vivo перепрограммирование опухолевых клеток в обычные дендритные клеточные клетки 1-го типа

Мы исследуем in vivo программирование раковых клеток в cDC1-подобные клетки в качестве новой стратегии иммунотерапии. Мы стремимся определить, может ли этот подход преобразовать иммунные холодные опухоли в иммунные горячие, тем самым объявив о противоопухолевом иммунитете. Мы устраняем ограничения существующих стратегий генерации cDC1 in vivo, представляя протокол преобразования раковых клеток в иммуногенные cDC1-подобные клетки непосредственно внутри опухоли, что позволяет изучать иммунные реакции, вызванные cDC1, in situ.

Наш управляемый протокол программирования in vivo надежно генерирует зрелые иммуногенные cDC1-подобные клетки, преодолевая супрессивное микроокружение опухоли, а поскольку эти клетки генерируются непосредственно in vivo, такой подход устраняет необходимость в производстве иммунных клеток in vitro. Наши результаты закладывают основу для переноса in vivo перепрограммирования, опосредованного транскрипционным фактором, в клинику, представляя готовую, но персонализированную иммунотерапию рака, которая вызывает устойчивые противоопухолевые иммунные реакции. В дальнейшем мы изучаем, как перепрограммирование cDC1-подобных клеток может вызвать формирование третичных клеток и инфраструктуры, и приводит ли это к гуморальному иммунитету.

Кроме того, мы также изучаем его потенциальную синергию с другими иммунотерапевтическими подходами. Для начала культивируйте клетки HEK 293T до тех пор, пока они не достигнут конфлюенции от 70 до 80%. Теперь тщательно перебейте приготовленную трансфекционную смесь, содержащую транспортную плазмиду, в течение одной минуты и инкубируйте смесь в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование липидного комплекса ДНК.

Аспирируйте среду из клеток HEK 293T и добавьте 10 миллилитров DMEM без пенициллина стрептомицина и с добавлением 10% FBS. Затем добавьте смесь для трансфекции по каплям на 150-миллиметровые пластины и инкубируйте в течение 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. После инкубации замените среду 20 миллилитрами полной среды DMEM с добавлением одного миллимолярного бутирата натрия и инкубируйте клетки в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Далее соберите лентивируссодержащую надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл через 48 и 60 часов после трансфекции. После первого сбора добавьте 12 миллилитров предварительно подогретого полного DMEM на 150-миллиметровую пластину для второго урожая. Отфильтруйте собранную жидкость через фильтр из полиэфирсульфонов с низким содержанием связывания белков толщиной 0,45 микрометра.

Пипетка 37 грамм лентивируссодержащей среды в тонкостенные полипропиленовые пробирки объемом 38,5 миллилитров с открытым верхом. Центрифугируйте пробирки в качающемся роторе при температуре 25 000 G в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.

Поместите тонкостенные полипропиленовые трубки с открытым верхом вверх дном на лабораторную салфетку или аналогичный абсорбирующий материал на пять минут, чтобы слить лишнюю жидкость и высушить гранулы. Далее добавьте в каждую гранулу 200 микролитров ледяного DMEM с добавлением HEPES или PBS и переложите смесь в микроцентрифужную пробирку, помещенную в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Инкубируйте гранулу в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы обеспечить полную суспензию.

Смешайте все ресуспендированные гранулы в одном контейнере, распределите вирусный запас в меньшие объемы от 50 до 200 микролитров и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного использования. После экспансии раковых клеток подготовьте клеточные суспензии к трансдукции, чтобы достичь соотношения EGFP-положительных и EGFP-отрицательных клеток, близкого к одному на третий день. Добавьте в клеточную суспензию восемь микрограммов на миллилитр полибрена, а затем соответствующий объем лентивируса, как было определено ранее.

Аккуратно перемешайте содержимое, не образуя пузырьков. Теперь нанесите пипеткой два миллилитра приготовленной клеточной суспензии, содержащей один умножить на 10 в степени пяти клеток, в каждую лунку шестилуночного планшета для культуры тканей и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Через 24 часа удалите лентивируссодержащую среду из каждой лунки.

Промойте лунки два раза PBS. Добавьте по 500 микролитров трипсина в каждую лунку и инкубируйте в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Далее осмотрите лунки под световым микроскопом, чтобы подтвердить полное отслоение клеток от пластины.

Затем соберите клетки с помощью готовых сред в конические пробирки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте ячейки в течение пяти минут при 350 G, чтобы гранулировать их. Промойте гранулу PBS.

Возьмите аликвоту и оцените жизнеспособное количество клеток с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим. Затем ресуспендируйте конечную клеточную гранулу в ледяной PBS для достижения концентрации от двух до четырех умножить на 10 в степени семи клеток на миллилитр, что соответствует одному-двум умножить на 10 в степени шести клеток в 50 микролитрах на опухоль. Поместите клетки на лед и переместите в зону эксперимента на животных.

После обезболивания мыши CD45.1 поместите ее на греющую подушку, чтобы предотвратить переохлаждение. Нанесите крем для глаз на мышь, чтобы предотвратить обезвоживание глаз во время анестезии. С помощью бритвы побрейте правый бок мыши.

По желанию отметьте мышь машинкой для стрижки ушей. Продезинфицируйте выбритый участок и удалите оставшиеся волосы тампоном, смоченным на 70% этаноле. Теперь с помощью пипетки P1000 тщательно суспендируйте раковые клетки.

Загрузите полностью ресуспендированную суспензию клеток в шприц объемом 0,5 миллилитра, оснащенный иглой 30 калибра. Аккуратно приподнимите кожу на бритом боку мыши с помощью двух пальцев и введите кончик иглы шприца в складку, образованную подтянутой кожей. Освободите подтянутую кожу, удерживая шприц на месте одной рукой.

Другой рукой растяните верхнюю часть кожи двумя пальцами. Медленно введите 50 микролитров суспензии раковых клеток, чтобы создать видимую подкожную припухлость овальной формы в месте инъекции. После процедуры инъекции наблюдайте за животным до тех пор, пока оно полностью не придет в себя от наркоза, чтобы обеспечить выживание.

Клетки HEK 293T, трансфицированные плазмидой SFFV-PIB-eGFP, показали четкую экспрессию eGFP через 24 часа после трансфекции, что подтверждает успешную доставку плазмы. Через 72 часа после трансдукции клетки меланомы показали успешную доставку факторов перепрограммирования и eGFP. На девятый день после имплантации клеток перепрограммирование in vivo дало более высокий процент полностью перепрограммированных CD45-положительных, MHC-II-положительных, cDC1-подобных клеток, чем в условиях in vitro.

На третий день после имплантации опухоли PIB-eGFP показали заметно более высокую инфильтрацию CD45-положительных иммунных клеток, чем в контрольной группе eGFP, что указывает на раннюю иммунную ремодель. К девятому дню средняя интенсивность флуоресценции CD45 на площадь опухоли оставалась значительно выше в опухолях PIB-eGFP, чем в контрольной группе. Третичные лимфоидные структуры стали обнаруживаться в опухолях PIB-eGFP к девятому дню, что указывает на структурные иммунные изменения в микроокружении опухоли.