SCAnED - макрос сегментации кожи с открытым исходным кодом для полуавтоматического обнаружения клеток и ядер в эпидермальных и дермальных отделах кожи

В нашей работе мы изучаем регуляторные механизмы, поддерживающие гомеостаз тканей на молекулярном, клеточном, структурном и механическом уровнях. Наша цель — понять патологические состояния, такие как воспаление кожи или рак. С помощью новых высококачественных инструментов визуализации и мультиомики мы теперь можем картировать изменения экспрессии клеток и генов в тканях в 2D и 3D.

Это действительно расширяет наше понимание того, как болезни развиваются и прогрессируют. Одна из главных проблем сейчас — огромное количество данных, генерируемых продвинутой микроскопией. И хотя существует больше инструментов для анализа изображений, они часто не удобны для людей без большого опыта или довольно дорогие.

Наш протокол предлагает бесплатный удобный инструмент для анализа клеток кожи человека как в эпидермисе, так и в дерме. Это повышает точность по сравнению с обычными инструментами и не требует опыта программирования или предварительного анализа изображений. Для начала откройте изображения иммунофлуоресценции на Fiji или Image J, используя биоформаты с настройками по умолчанию.

Не разделяйте каналы на этом этапе. Скачайте макрос SCAnED и запустите его, выбрав плагины. Затем макросы и нажатие «Запустить».

Выберите макро-скрипт SCAnED при запросе. Следуйте инструкциям на экране, предоставленным макросом. Выберите канал E-cadherin по запросу макроса.

Далее перейдите к изображению, выберите настройки, затем ручную регулировку порога для канала E-cadherin. Нажмите OK, когда эпидермальная область полностью зафиксирована. Затем выберите канал DAP-E, когда появляется запрос на сегментацию.

Автоматически определите уровни интенсивности сегментации ядер при использовании пороговой функции. Для StarDist откройте плагин в Image J. Загрузите модель обнаружения ядер в графический интерфейс StarDist и нажмите на канал ядер, чтобы выбрать его для анализа. Теперь настройте тайлы в StarDist так, чтобы они соответствовали ожидаемому размеру патча — 256 на 256 пикселей.

При запросе выберите «да» для измерения интенсивности маркера внутри ядр. Затем повторите процесс сегментации и анализа для каждого флуоресцентного канала. После обработки всех каналов сохраняйте выходные данные в виде файлов значений с разделёнными запятой, как указано макросом.

Для цитоплазматической области, когда сегментация ядер выполнена с использованием пороговой функции, применяется бинарная дилатация для расширения интересуемой ядерной области. Когда StarDist используется для сегментации ядер, применяйте расширение расширения к интересующей ядерной области. Выберите «да» при попытке измерить интенсивность маркеров в области всей клетки.

Затем сохраняйте полученные файлы данных в формате значения с разделёнными запятыми согласно макроинструкциям. Установите пороги интенсивности, специфические для маркеров, используя контрольные образцы изотипа. Скачайте соответствующий блокнот Jupyter и перейдите в Google Collab, чтобы выбрать файл, затем открытый блокнот.

Выберите файл и запустите кодовые ячейки последовательно. Если появится опция выбрать файлы, нажмите кнопку и загрузите файл с разделённым значением с запятой. Для каждого антитела вычислите среднюю интенсивность флуоресценции с помощью контрольных файлов изотипа.

Чтобы определить пороги среза, откройте блокнот с точным графиком, загрузите контрольные данные изотипа и запустите код. Исходя из распределения точек на графиках как для контроля изотипов, так и для специфических антител, выберите порог интенсивности, чтобы отличить фоновый сигнал от истинной экспрессии маркера. Используйте этот порог для классификации каждой ячейки как положительной или отрицательной для данного маркера.

Наконец, создайте точечные графики для визуализации паттернов совместного выражения маркеров, запустив код точечного графика в блокноте Google Collab. На ручных сегментированных изображениях виментин-положительные клетки демонстрировали сильный цитоплазматический сигнал с чёткими границами ROI, покрывающими всё тело клетки. Полуавтоматическая сегментация SCAnED захватила положительные клетки с виментином с похожими границами с использованием подхода порога и дилатации.

Количественное сравнение интенсивности виментина в 21 клетке не выявило значимой разницы между ручной и SCAnED сегментацией. Анализ гистограммы показал более высокую частоту виментин-положительных клеток в дерме псориаза по сравнению со здоровой кожей. Анализ дермальных клеток на основе точечного графика показал увеличение положительных CD-90 положительных виментиновых клеток при псориазе по сравнению со здоровой кожей.

В эпидермисе образцы псориаза показали увеличение CD-90 положительных виментин-отрицательных клеток, возможно, кератиноцитов, по сравнению со здоровой кожей. Количество положительных клеток Виментина в псориатической и здоровой эпидермисе было сопоставимо между SCAnED и QuPath. визуальная сегментация показала, что SCAnED точнее назначал пограничные клетки эпидермису, чем QuPath, который ошибочно распределял несколько клеток.