Разработка органоидных линий, полученных от мышей, из эпителиальных клеток фаллопиевых труб для моделирования высокодифференцированной серозной карциномы яичников

Так что да, сейчас мы работаем над разработкой новых моделей высокостепенной серозной карциномы яичников, которые являются сингенными в том смысле, как описано в протоколе. Мы берём здоровые маточные трубы у здоровых мышей, затем выводим их в виде органоидов в чашке Петри и добавляем им все те ошибки или генетические модификации, которые обычно встречаются в обычной человеческой версии болезни. Это очень интересно, потому что с одной стороны, можно изучать всевозможные внутренние факторы этих опухолей внутри чашки Петри в виде органоидов, которые более реалистичны, чем традиционные двумерные культуры.

Но дело в том, что поскольку есть сингенные модели, можно взять эти органоиды и вернуть их мыши, чтобы посмотреть, как опухоль развивается и взаимодействует с хозяином. Это позволяет нам иметь гораздо более целостное представление о том, как на самом деле происходит опухоль и опухологенез, и мы надеемся, что это даст нам гораздо лучшие инструменты и лучшее понимание того, как это заболевание работает и как с ней лучше бороться. Для начала приобретите усыпанных самок чёрных мышей C57 6J.

Удалите яичник и маточную трубу и переместите их в стерильную чашку Петри с DMEM, дополненную пенициллин стрептомицином при 4 градусах Цельсия. Используйте вскрытие микроскопа, тонкие щипцы и ножницы, чтобы удалить остатки жира из яичника. Изолировать маточную трубу, включая инфундибулум и часть дистальной ампулы, от яичника и матки.

Теперь перенесите очищенную ткань в трубку с полной смесью для пищеварения. С помощью тонких ножниц измельчите маточную трубку на куски размером менее 0,5 миллиметра. Затем инкубировать трубку при 37 градусах Цельсия в течение 40–50 минут перед проведением культивирования органоидов.

Для разработки модели опухоли у мышей было установлено пять инъекций, каждая из которых содержала четыре миллиона клеток, ресуспендированных в недобавленном матриксе Opti-MEM I — ледяной базальной мембране. Для подготовки инъекций сначала выдалите пузырьки воздуха из мёртвого объёма шприца с инсулином U-100, оснащённого иглой 28-го калибра, с использованием холодного PBS. Затем медленно наполняйте шприц 40 микролитрами клеток и держите загруженные шприцы на льду, пока мыши не будут анестезированы.

Когда шприцы будут готовы к инъекции, разместите шприцы рядом с нагревательной лампой, чтобы матрица базальной мембраны нагрелась и увеличила вязкость, что облегчило инъекции и пришивку. Далее поместите мышь в заранее нагретую клетку под нагревающей лампой, чтобы подготовиться к операции. Сделайте разрез менее одного сантиметра вдоль бока, над бедром анестезиированной мыши.

Прорежьте эпидермис и гиподермис, чтобы добраться до области бурсы. Аккуратно вытяните яичник, найдя прикреплённую жировую подушечку. Затем, используя подготовленный шприц, введите клетки через жировую подушечку и яичник в яйцеводный мешок.

Аккуратно возвращайте яичник в бурсу. Закройте мышечный слой швами без кос. Затем закройте кожный разрез хирургическими скобами.

Поместите мышь обратно в тёплую клетку и поддерживайте температуру тела с помощью нагревающей лампы до полусознания, обычно более 15 минут. Органоиды, полученные из мышиного эпителия маточной трубки, имеют чётко выраженную сферическую и чёткую форму примерно через пять дней и требуют упаковки примерно на 10–12 день. Органоиды дикого типа преобразуются в предраковые опухолоиды с помощью методов генной инженерии, таких как лентивирусная или ретровирусная гиперэкспрессия генов.

Отдельные клоновые клеточные линии, полученные из генетически модифицированных органоидов, могут быть дополнительно изучены in vivo путём инъекции в бурсу яичника. Обычно опухоли достигают размера от двух до трёх сантиметров примерно через 60 дней после инъекции. Ну, мы говорим, как я уже отмечал, что главное преимущество того, как работает этот протокол, — это генерация сингенетических моделей, верно?

И поскольку они сингенетические, как я уже говорил, можно действительно оценить взаимодействие между целым животным, полноценной мышью, и опухолью, которая развивается, при этом имея полный контроль над генетикой опухоли. И, конечно, по сравнению с другими моделями, где, возможно, вы пытаетесь понять иммунную систему внутри чашки Петри, воспроизвести иммунную систему в чашке Петри будет очень сложно. Или если взять PDX, то есть образцы опухолей от пациентов, которые затем помещают мышам, то для работы у мышей не может быть иммунной системы, иначе опухоль отвергнет, верно?

Но поскольку эта модель сингенетная, можно действительно оценить полное взаимодействие всего хозяина с опухолью, особенно с иммунной системой, которая сейчас является одной из самых горячих областей исследований в этой области. Так что я действительно считаю, что это самое важное преимущество этого протокола по сравнению с другими протоколами, которые можно найти в других местах. На самом деле мы уже используем эти модели для исследования очень интересных явлений.

Я бы сказал, что сейчас меня особенно интересует, как адаптивная иммунная система, судя по нашим наблюдениям, оказывается важным фактором формирования геномных свойств, особенно вариаций числа копий высокостепенных серозных карцином, в том смысле, что если иммунной системы нет, кажется, что эти опухоли не развивают столь масштабные и сложные перестройки ДНК. Поэтому мы пытаемся понять, как это происходит и как, надеюсь, попытаться изменить ситуацию, чтобы усилить любые иммунные терапии против этого.