Быстрая оптимизация светоиндуцируемой системы для контроля экспрессии генов млекопитающих

Цель этого проекта — разработать высокопроизводительный метод оптимизации и характеристики многокомпонентного оптогенетического инструмента под названием LACE для экспрессии генов млекопитающих. Для начала поместите флягу с Т-клетками HEK 293 внутри шкафа для биобезопасности. Используйте серологическую пипетку для аспирации отработанной среды.

Пипетить 10 миллилитров DPBS в один угол колбы и аккуратно промить клетки. Затем аспирируйте раствор для промывки и выбросьте и DPBS, и аспиратор в контейнер для отходов. Теперь добавьте 1,5 миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу, чтобы покрыть поверхность, и инкубировать.

Аккуратно постучите по фляжке, чтобы ослабить клетки с поверхности. Затем пипетка 8,5 миллилитров свежего DMEM в колбу. Аспирируйте раствор вверх и вниз, пока не останутся заполнения, чтобы снова суспензировать ячейки.

Затем перенесите девять миллилитров суспензии клетки в 15-миллилитровую коническую трубку. Добавьте девять миллилитров свежего DMEM в колбу. Инкубировать суспензию до слияния под 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия.

Теперь смешайте 10 микролитров взвешенных клеток с 10 микролитрами красителя трипсинов в соотношении один к одному, чтобы рассчитать концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Засейте примерно 35 000 ячеек по 100 микролитров в каждую яму, с высокопроизводительной пластиной с числом 1,5, чёрной, 96-луночной, стеклянной пластиной. Поставьте тарелку в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 24 часа.

Для трансфекции сначала аликвотируйте 11 микролитров тёплого DMEM без сыворотки в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку для одной скважины и 10% излишка. Подготовьте различные массовые соотношения плазмидных веществ зелёного флуоресцентного белка, усиленного CRY2, и CIBN-гидной РНК/Aliquot 110 нанограммов на каждую яму, в каждую пробирку с аликвотами без сыворотки. Затем пипетить дополнительно 11 микролитров DMEM без сыворотки для каждой скважины в отдельные трубки для разбавления трансфекционного реагента.

Добавьте разбавленный трансфекционный реагент в смесь среды ДНК и инкубируете, образуя трансфекционные комплексы. Затем пипетка по 20 микролитров подготовленного трансфекционного комплекса в каждую яме пластины с 96 лунками, содержащей Т-клетки HEK 293. Оберните пластину с 96 скважинами в алюминиевую фольгу и поместите её в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия под содержанием 5% углекислого газа на 24 часа.

Для начала процесса активации модифицируйте входной код микроконтроллера, чтобы освещать нужные ямы с помощью указанных строк скриптов. Установите интенсивность светодиода, излучающего свет, на 9,27 милливатт на квадратный сантиметр, используя указанные кодовые линии. Отрегулировать длину импульса на одну секунду, затем установить частоту импульса на 0,067 герц, что эквивалентно каждые 15 секунд.

Распылите 3D-печатную крышку OptoPlate 70% этанолом. Затем оставьте его высохнуть в шкафу для биобезопасности. Теперь включите красный свет в фотолаборатории.

Поставьте пластину на 96 лунок в шкаф биобезопасности. Замените крышку пластины на засохшую 3D-печатную крышку. Поставьте 96-ядровую пластину на светодиодную решетку для сборки активации.

Установите полностью собранный светодиодный массив в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 24 часа. Подключите микроконтроллер, светодиод и порты вентилятора к источнику питания. Для проведения проточной цитометрии запустите программу запуска системы на экспертном программном обеспечении сайта.

Загрузите два миллилитра деионизированной воды в погрузчик пробы. Запускайте контроль качества с помощью предоставленных бусин. Настройте и определите образцы скважин для приобретения.

Создайте графики и таблицы для бокового и прямого рассеяния, высоты бокового рассеяния против площади бокового рассеяния, площади бокового рассеяния против FITC-A, а также таблицу статистики FITC-A. Теперь вставьте пластину с V-образным дном на 960 лунок в погрузчик цитометра. Выберите нетрансфектированную яму, нажмите Initialize, затем Run.

Скорректируйте боковое рассеяние и напряжения FTC, чтобы центрировать интересующую популяцию на графике SSC-A против FSC-A. Нажмите «Запустить», затем выберите зелёный флуоресцентный белок, усиленный CMV, хорошо трансфицированный. Скорректируйте напряжение FITC так, чтобы включить как автофлуоресцентные, так и флуоресцентные элементы в график SSC-A против FITC-A.

Создайте полигон, чтобы ограничить здоровую популяцию клеток. Второй многоугольник для различения дублетов на графике SSC-H против SSC-A. Создайте многоугольник, чтобы отличать флуоресценцирующие ячейки от нефлуоресценцирующих, используя элемент из нетрансфекционированных ячеек в качестве ориентира.

Автоматически записывайте образцы со скоростью 60 микролитров в минуту до тех пор, пока не пройдёт 200 секунд или не достигнет 10 000 событий. Затем экспортировать средние значения FTC в CSV-файл и анализировать данные. Очистите потоковый цитометр, выбрав опцию ежедневной чистки.

Флуоресцентная визуализация показала, что при соотношении масс один к девяти активация синего света вызывает более низкую максимальную экспрессию eGFP по сравнению с соотношением пять к пяти, которое также демонстрирует повышенную протечность в условиях темноты. Потоковая цитометрия показала, что более 95% забложенных событий в P1 были синглетами во всех условиях. А нетрансфицированные клетки имели менее 0,1% eGFP-положительной популяции.

Контроль CMV-eGFP содержал примерно 99% положительных клеток eGFP, тогда как трансфекционные клетки с 2pLACE имели примерно 57%. Трансфектированные клетки CMV-eGFP демонстрировали сильную конститутивную экспрессию eGFP как при светлых, так и при тёмных условиях, тогда как нетрансфицированные клетки не демонстрировали видимой флуоресценции. Также было подтверждено успешное трансфекцию 2pLACE и активацию экспрессии eGFP под синим светом с более низкой экспрессией, чем CMVeGFP. В светоактивированных образцах 2pLACE экспрессии eGFP наблюдалось в три раза по сравнению с тёмными условиями.

Процент eGFP-положительных клеток в образцах, трансфекционных 2pLACE, составлял примерно 60%. Соотношение массы три к семи обеспечивало наивысшую среднюю интенсивность флуоресценции и динамический диапазон. Этот протокол позволяет оценивать образцы с высокой пропускной способностью и выполнять техническое воспроизведение с помощью OptoPlate для программирования различных световых условий и частот импульсов.