Трехмерная количественная оценка кишечной слизи с помощью визуализации целых тканей
12 сентября 2025 г.
В этом исследовании представлен метод 3D-визуализации с использованием целых тканей кишечника и многофотонной микроскопии для количественного определения секретируемой слизи, что позволяет проводить точный объемный анализ и визуализацию динамики слизи в ответ на такие стимулы, как карбамоилхолин хлорид.
Наши исследования сосредоточены на механизмах микробной инъекции в слизистые ткани, подчёркивая ключевую роль слизи в модулировании этих взаимодействий. Традиционная двумерная количественная оценка слизи пропускает пространственные и объёмные детали. Наш протокол позволяет проводить точный 3D-анализ, выявляя структурные и распределительные изменения в результате молекулярных вмешательств, упущенных в существующих методах.
Этот протокол сочетает гормональную визуализацию с 3D-количественной оценкой, обеспечивая надёжные воспроизводимые измерения архитектуры кишечной слизи, применимые к различным экспериментальным условиям, а также молекулярные вмешательства, превосходящие традиционную двумерную оценку. Для начала поместите анестезированную мышь от шести до восьми недель на грелку, чтобы поддерживать температуру тела. Продезинфицируйте кожную поверхность мыши спиртом и сделайте разрез в левой нижней части живота, чтобы обнажить слепую кость при сохранении анестезии.
Теперь определите подвздошную или проксимальную кишку. Положите кишечную петлю на стерильную марлю. Прополосните стерильным PBS и закрепите оба конца артериальными зажимами, чтобы создать замкнутую петлю длиной три сантиметра.
Под наркозом введите не более 200 микролитров стерильного реагента PBS или карбамоилхолина хлорида в связанную кишечную петлю. После 30 минут лечения извлеките кишечную петлю у усыпленного животного. С помощью щипцов держите кишечную петлю и аккуратно прополосните её в стерильном PBS.
Разрежьте кишечную петлю вдоль небольшой неразрезанной части и снова прополосните ткань стерильным PBS. Расплющите ткань в шестисантиметровой тарелке и разрежьте оставшуюся порцию. Используйте сегменты медной проволоки, чтобы закрепить её на основании агарозы.
Теперь добавьте 10 миллилитров раствора 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать ткань на 12–24 часа. После инкубации удалите раствор параформальдегида и промыйте ткань не менее трёх раз PBS, чтобы удалить остатки параформальдегида. Затем погрузите ткань в 10 миллилитров блокирующего буфера, состоящего из PBS, дополненного 0,4% тритона X-100 и 3% BSA, и храните при 4 градусах Цельсия в течение 12–24 часов.
Уберите блокирующий буфер. Окрашивайте ткань раствором красителя, содержащим зародыши пшеницы агглютинин и фаллоидин. В тонких и толстой тканях, обработанных PBS, WGA-положительная слизь преимущественно локализовалась внутри кубковых клеток на поверхности эпителия.
После обработки карбамойлхолином хлоридом количество WGA-положительной слизи в просвете кишечника заметно увеличилось как в тонком кишечнике, так и в толстой кишке, но слизь распределялась спорадически, а не образовывала непрерывный слой. Объём слизи, связанной с GGA-положительными клетками, значительно снизился после обработки карбамоилхолином хлоридом как в тонком кишечнике, так и в толстой кишке, что указывает на активную секрецию. Все объёмы слизи, объём слизи, в тканях, обработанных PBS, находились менее 1 000 кубических микрометров.
WGA-положительные вещества объёмом более 1 000 кубических микрометров классифицировались как секретируемая слизь в просвете. Лечение карбамоилхолином хлоридом увеличило общий объём секретируемой слизи примерно в пять–двадцать раз как в тонком кишечнике, так и в тканях толстой кишки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый протокол 3D-визуализации кишечной слизи с использованием целых образцов тканей и многофотонной микроскопии. Метод позволяет проводить точный волюметрический анализ и визуализировать динамику слизи в ответ на различные стимулы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Мукозальная иммунология
Теоретическая часть
- Понимание динамики слизи имеет решающее значение для изучения взаимодействий микробов с слизистыми тканями.
- Традиционные 2D-методы не позволяют зафиксировать пространственные и объемные детали строения слизи.
- 3D-анализ позволяет получить представление о структурных изменениях слизи, вызванных молекулярным воздействием.
- Данное исследование направлено на повышение точности количественной оценки слизи.
Цель исследования
- Разработать протокол для точного 3D-количественного анализа кишечной слизи.
- Выявить структурные изменения и изменения в распределении слизи.
- Улучшить методы измерения архитектуры кишечной слизи при различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- Подготовка целого препарата кишечной ткани.
- Мультифотонная микроскопия для визуализации.
- Визуализация гормонов в сочетании с 3D-количественным анализом.
- Использование анестезированных мышей для сбора тканей.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает надежное и воспроизводимое измерение слизи.
- 3D-визуализация позволяет выявить детали, которые упускаются при традиционном 2D-анализе.
- В ответ на стимулы наблюдаются структурные изменения динамики слизи.
- Метод применим к различным экспериментальным условиям.
Выводы
- Данное исследование представляет собой значительный прогресс в методах количественного определения слизи.
- 3D-визуализация расширяет наше понимание роли слизи в микробных взаимодействиях.
- Данный протокол может быть использован для различных молекулярных воздействий в исследовательских целях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точное трехмерное количественное определение кишечной слизи восполняет критический пробел в исследованиях желудочно-кишечного тракта на этапе поиска новых мишеней, обеспечивая абсолютный волюметрический и пространственный анализ секреции слизи. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при оценке функции слизистого барьера и влияния молекулярных воздействий, что способствует принятию взвешенных с учетом рисков решений при ранней валидации мишеней и снижении рисков при изучении механизмов. Воспроизводимость данного протокола и количественные результаты позволяют рассматривать его как базовый инструмент для развития разработок в области биологии слизистых оболочек и иммунологических портфелей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся целостности слизистого барьера и взаимодействий между хозяином и микроорганизмами.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения секреции и распределения слизи, индуцированных стимулом.
- Способствует снижению механистических рисков за счет выявления структурных и объемных изменений в ответ на молекулярные вмешательства.
- Предоставляет надежные данные для отбора и приоритизации мишеней в области желудочно-кишечного тракта в рамках портфеля разработок.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы целых тканей для последующего скрининга модуляторов, влияющих на секрецию слизи.
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и количественных данных об объеме для разработки анализа.
- Обеспечивает масштабируемость и возможность повторного использования платформы при различных экспериментальных условиях и молекулярных стимулах.
- Поддерживает надежную оценку воздействия соединений на архитектуру слизи и динамику секреции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям соответствующих заболеваний за счет количественного определения динамики слизи в физиологических и патологических условиях.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя абсолютные количественные данные.
- Обосновывает решения о продвижении проекта с учетом рисков на основе надежных волюметрических и пространственных показателей.
- Улучшает прогностическую оценку рисков для разработки трансляционных биомаркеров в исследованиях слизистых оболочек.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, получение количественных показателей и снижение механистических рисков в рабочих процессах исследований желудочно-кишечного тракта.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем количественного определения секреции слизи в ответ на определенные стимулы.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные об объеме, готовые для анализа, с целью оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет абсолютные измерения и данные о пространственном распределении для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывают результаты открывательных исследований с доклиническими моделями, обеспечивая визуализацию и количественную оценку динамики слизи in situ.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации и количественного анализа для различных областей исследований слизистых оболочек.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и устраняет неопределенность в механизмах при исследовании слизистого барьера.
- Операционная ценность: Стандартизирует количественное определение объема и повышает воспроизводимость результатов в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок, а также повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и развивать программы по изучению иммунологии желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке целых тканей и использовании многофотонной микроскопии.
- Необходим доступ к передовым платформам визуализации и аналитическому программному обеспечению для 3D-количественного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки и окрашивания тканей.
- Метод может быть адаптирован для различных отделов кишечника и экспериментальных стимулов путем оптимизации протокола.
- Результаты зависят от точности определения волюметрических порогов и критериев классификации для количественной оценки слизи.
