Трехмерная количественная оценка кишечной слизи с помощью визуализации целых тканей
September 12th, 2025
В этом исследовании представлен метод 3D-визуализации с использованием целых тканей кишечника и многофотонной микроскопии для количественного определения секретируемой слизи, что позволяет проводить точный объемный анализ и визуализацию динамики слизи в ответ на такие стимулы, как карбамоилхолин хлорид.
Наши исследования сосредоточены на механизмах микробной инъекции в слизистые ткани, подчёркивая ключевую роль слизи в модулировании этих взаимодействий. Традиционная двумерная количественная оценка слизи пропускает пространственные и объёмные детали. Наш протокол позволяет проводить точный 3D-анализ, выявляя структурные и распределительные изменения в результате молекулярных вмешательств, упущенных в существующих методах.
Этот протокол сочетает гормональную визуализацию с 3D-количественной оценкой, обеспечивая надёжные воспроизводимые измерения архитектуры кишечной слизи, применимые к различным экспериментальным условиям, а также молекулярные вмешательства, превосходящие традиционную двумерную оценку. Для начала поместите анестезированную мышь от шести до восьми недель на грелку, чтобы поддерживать температуру тела. Продезинфицируйте кожную поверхность мыши спиртом и сделайте разрез в левой нижней части живота, чтобы обнажить слепую кость при сохранении анестезии.
Теперь определите подвздошную или проксимальную кишку. Положите кишечную петлю на стерильную марлю. Прополосните стерильным PBS и закрепите оба конца артериальными зажимами, чтобы создать замкнутую петлю длиной три сантиметра.
Под наркозом введите не более 200 микролитров стерильного реагента PBS или карбамоилхолина хлорида в связанную кишечную петлю. После 30 минут лечения извлеките кишечную петлю у усыпленного животного. С помощью щипцов держите кишечную петлю и аккуратно прополосните её в стерильном PBS.
Разрежьте кишечную петлю вдоль небольшой неразрезанной части и снова прополосните ткань стерильным PBS. Расплющите ткань в шестисантиметровой тарелке и разрежьте оставшуюся порцию. Используйте сегменты медной проволоки, чтобы закрепить её на основании агарозы.
Теперь добавьте 10 миллилитров раствора 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать ткань на 12–24 часа. После инкубации удалите раствор параформальдегида и промыйте ткань не менее трёх раз PBS, чтобы удалить остатки параформальдегида. Затем погрузите ткань в 10 миллилитров блокирующего буфера, состоящего из PBS, дополненного 0,4% тритона X-100 и 3% BSA, и храните при 4 градусах Цельсия в течение 12–24 часов.
Уберите блокирующий буфер. Окрашивайте ткань раствором красителя, содержащим зародыши пшеницы агглютинин и фаллоидин. В тонких и толстой тканях, обработанных PBS, WGA-положительная слизь преимущественно локализовалась внутри кубковых клеток на поверхности эпителия.
После обработки карбамойлхолином хлоридом количество WGA-положительной слизи в просвете кишечника заметно увеличилось как в тонком кишечнике, так и в толстой кишке, но слизь распределялась спорадически, а не образовывала непрерывный слой. Объём слизи, связанной с GGA-положительными клетками, значительно снизился после обработки карбамоилхолином хлоридом как в тонком кишечнике, так и в толстой кишке, что указывает на активную секрецию. Все объёмы слизи, объём слизи, в тканях, обработанных PBS, находились менее 1 000 кубических микрометров.
WGA-положительные вещества объёмом более 1 000 кубических микрометров классифицировались как секретируемая слизь в просвете. Лечение карбамоилхолином хлоридом увеличило общий объём секретируемой слизи примерно в пять–двадцать раз как в тонком кишечнике, так и в тканях толстой кишки.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование представляет новый протокол для 3D-визуализации кишечного слизи с использованием целостных тканей и многофотонной микроскопии. Он позволяет проводить точный объемный анализ и визуализацию динамики слизи в ответ на различные стимулы.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Мукозальная иммунология
Фон
- Понимание динамики слизи важно для изучения микробных взаимодействий с мукозными тканями.
- Традиционные 2D-методы не могут захватить пространственные и объемные детали слизи.
- 3D-анализ предоставляет представление о структурных изменениях в слизи из-за молекулярных вмешательств.
- Это исследование направлено на улучшение точности количественной оценки слизи.
Цель исследования
- Разработать протокол для точной 3D-оценки кишечного слизи.
- Выявить структурные и распределительные изменения в слизи.
- Улучшить измерения архитектуры кишечного слизи в различных экспериментальных условиях.
Использованные методы
- Приготовка целостных кишечных тканей.
- Многофотонная микроскопия для визуализации.
- Комбинация гормонального имэйджинга с 3D-количественной оценкой.
- Использование наркотизированных мышей для сбора тканей.
Основные результаты
- Протокол позволяет проводить надежные и воспроизводимые измерения слизи.
- 3D-визуализация раскрывает детали, недоступные при обычных 2D-оценках.
- Структурные изменения в динамике слизи наблюдаются в ответ на стимулы.
- Метод применим к различным экспериментальным условиям.
Выводы
- Это исследование предоставляет значительное улучшение в методах количественной оценки слизи.
- 3D-визуализация улучшает наше понимание роли слизи в микробных взаимодействиях.
- Протокол может быть использован для различных молекулярных вмешательств в исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Accurate three-dimensional quantification of intestinal mucus addresses a critical gap in discovery-stage gastrointestinal research by enabling absolute volumetric and spatial analysis of mucus secretion. This capability enhances predictive confidence in evaluating mucosal barrier function and the impact of molecular interventions, supporting risk-adjusted decisions in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational tool for pipeline advancement in mucosal biology and immunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to mucosal barrier integrity and host-microbe interactions.
- Supports functional target validation by quantifying stimulus-induced mucus secretion and distribution.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural and volumetric changes in response to molecular interventions.
- Provides robust data for portfolio triage and prioritization of gastrointestinal targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated whole-mount tissue systems for downstream screening of modulators affecting mucus secretion.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative volumetric outputs for assay development.
- Enables scalability and platform reuse across diverse experimental conditions and molecular stimuli.
- Supports reliable evaluation of compound effects on mucus architecture and secretion dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by quantifying mucus dynamics under physiological and pathological conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing absolute quantitative data.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on robust volumetric and spatial readouts.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker development in mucosal research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and mechanistic de-risking in gastrointestinal research workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying mucus secretion in response to defined stimuli.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative volumetric outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers absolute measurements and spatial distribution data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by enabling in situ visualization and quantification of mucus dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for diverse mucosal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mucosal barrier research.
- Operational Value: Standardizes volumetric quantification and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of gastrointestinal and mucosal immunology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount tissue preparation and multi-photon microscopy.
- Demands access to advanced imaging platforms and analytical software for 3D quantification.
- Necessitates cross-team standardization of tissue handling and staining protocols.
- Adaptable to various intestinal regions and experimental stimuli with protocol optimization.
- Dependent on precise volumetric thresholds and classification criteria for mucus quantification.
