Стимуляция эндотелиальных клеток сосудов с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек в присутствии липопротеинов низкой плотности

Нейтрофильные внеклеточные ловушки участвуют в самых разных заболеваниях, в том числе сердечно-сосудистых. Тем не менее, синергетическое воздействие образования НВЛ и липопротеинов на сосудистые клетки остается неясным. Используя этот протокол, на сегодняшний день продолжается механистический анализ того, как индуцируются воспалительные реакции в эндотелиальных клетках аорты человека, обработанных внеклеточными ловушками нейтрофилов и липопротеинами низкой плотности.

Мы продемонстрировали, что липопротеины высокой плотности действуют как супрессор образования НВЛ. Этому способствуют окисленные липопротеины низкой плотности, окисленные фосфолипиды и лизофосфолипиды. Для начала центрифугируйте от 45 до 50 миллилитров цельной человеческой крови, полученной в гепариновой пробирке при 700 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Медленно уменьшите скорость центрифуги после отжима, затем соберите верхний слой, содержащий фракцию плазмы. Центрифугируйте плазменную фракцию два раза при 700 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия для полного удаления клеток крови, сохраняя ту же настройку замедления. Затем добавьте один микролитр 250 миллимолярного раствора ЭДТА на один миллилитр плазмы, чтобы предотвратить ионно-опосредованное окисление двухвалентного металла липопротеинов.

Поместите 2,7 миллилитра плазмы в ультрацентрифужную пробирку. Накладка с 900 микролитрами PBS, содержащим 250 микромоляров ЭДТА. Затем ультрацентрифугируйте пробирку при 600 000 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.

Далее выбросьте 900 микролитров из верхнего слоя, чтобы устранить фракцию хиломикрона. Добавьте 900 микролитров PBS, содержащего ЭДТА, поверх оставшейся плазмы и ультрацентрифугуйте при 600 000 G в течение 2,5 часов при четырех градусах Цельсия. Выбросьте 900 микролитров верхнего слоя, чтобы исключить фракцию липопротеинов очень низкой плотности.

Затем добавьте в плазму 540 микролитров 0,5 грамма на миллилитр раствора бромида калия, чтобы довести плотность до 1,063. Аккуратно перемешайте содержимое с помощью пипетки и ультрацентрифуги при 600 000 G в течение 2,5 часов при четырех градусах Цельсия. Соберите 540 микролитров верхнего слоя, содержащего липопротеины низкой плотности.

Собранную фракцию перенесите в диализную мембрану и обработайте диализом против двух литров PBS, содержащих ЭДТА, при четырех градусах Цельсия в темноте, чтобы удалить бромид калия. Добавьте 152 микролитра 0,01% полилизина или 0,1% раствора желатина в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте при комнатной температуре не менее пяти минут. Затем достаньте раствор из лунок, промойте один раз 200 микролитрами стерильной воды, и дайте лункам полностью высохнуть при комнатной температуре.

Храните подготовленную тарелку при комнатной температуре до дальнейшего использования. Подготовьте пластины, покрытые желатином, следуя той же процедуре, что и для полилизина. Культивируют два раза по десять в степени шести клеток HL60 на 10 миллилитров в среде RPMI-1640 с добавлением двух микромоляров полностью транс-ретиноевой кислоты.

После четырех дней инкубации с полностью транс-ретиноевой кислотой соберите клетки HL60. Центрифугируйте собранные клетки при 220 G в течение четырех минут при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия. Отсадите надосадочную жидкость, затем промойте клетки равным объемом бессывороточной среды RPMI-1640.

Снова центрифугируйте промытые клетки при 220 G в течение четырех минут при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия и повторно суспендируйте клетки в бессывороточной среде RPMI-1640. После доведения концентрации клеток до двух умножденных на десять в степени шести клеток на миллилитр, засейте по 0,5 миллилитра суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета, предварительно покрытого полилизином. Добавьте 100 микролитров бессывороточной среды RPMI-1640 с 300 наномолярными форболами 12-миристат 13-ацетат или PMA или без них.

Культивируйте клетки в течение 30 минут. Далее извлеките среду из лунок. Промойте клетки один раз бессывороточной средой RPMI-1640 и замените ее бессывороточной средой RPMI-1640, содержащей ноль или 20 микрограммов на миллилитр липопротеинов низкой плотности.

Продолжайте культивировать клетки в течение двух часов. Соберите питательную среду из каждой лунки в пробирку и центрифугируйте при 700 G в течение трех минут при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Для стимуляции получают культуру эндотелиальных клеток аорты человека и заменяют отработанную среду 0,5 миллилитрами свежей питательной среды, а клетки инкубируют в течение 30 минут.

Наконец, добавьте 167 микролитров питательной среды, собранной из нейтрофильных клеток, содержащих нейтрофильные внеклеточные ловушки и ЛПНП, в чашки для эндотелиальных клеток аорты человека. Стимуляция эндотелиальных клеток аорты человека внеклеточными ловушками нейтрофилов приводила к дозозависимым морфологическим изменениям от булыжной до вытянутой формы. Морфологические изменения в эндотелиальных клетках аорты человека усиливались при стимуляции внеклеточными ловушками, индуцированными ЛПНП, при этом видимое удлинение проявлялось уже через шесть часов.