Развертываемая в полевых условиях безлинзовая платформа визуализации для быстрого безмаркерного анализа активации естественных клеток-киллеров

Наша цель состоит в том, чтобы быстро оценить иммунную функцию путем количественной оценки активации NK-клеток в режиме реального времени с использованием визуализации без меток и линз для улучшения иммунного мониторинга. Мы показали, что индекс врожденного иммунитета, или I3, надежно дифференцирует активность NK-клеток здоровых и иммунокомпрометированных доноров и сильно коррелирует с цитокинами и маркерами проточной цитометрии. Существующие анализы NK-клеток требуют меток, громоздких инструментов и длительного времени инкубации.

Наша платформа LSIT восполняет этот пробел, обеспечивая быстрое, доступное и безэтикеточное профилирование с помощью простой оптоэлектроники. Наша платформа LSIT без меток дифференцирует активацию NK-клеток на уровне одной клетки в течение 30 секунд с использованием теневых параметров, устраняя необходимость в окрашивании и дорогостоящей проточной цитометрии. Мы расширим LSIT для мониторинга активации Т- и В-клеток и интегрируем алгоритмы глубокого обучения для высокопроизводительной классификации различных состояний иммунных клеток.

Для начала достаньте наборы для изоляции естественных киллеров или NK-клеток из холодильника и дайте им нагреться до комнатной температуры, от 15 до 28 градусов по Цельсию. Подготовьте необходимое оборудование, разместив магнитный сепаратор, пипетки со стерильными наконечниками, а также установите инкубатор или нагревательный блок на 37 градусов Цельсия. С помощью пипетки добавьте 0,5 миллилитра цельной крови в реакционную пробирку с зеленой крышкой, содержащую коктейль антител.

Аккуратно перемешайте содержимое, пипетируя вверх и вниз по пробирке пять-шесть раз. Затем инкубируйте трубку в течение пяти минут. Переложите все содержимое пробирки с зеленым колпачком в разделительную пробирку с красным колпачком один раз с помощью пипетки и аккуратно перемешайте, пипетируя пробирку пять-шесть раз.

Поместите трубку с красной крышкой на магнитный сепаратор и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут. Удерживая магнит на месте, с помощью пипетки передайте примерно 1,5 миллилитра надосадочной жидкости в разделительную трубку с фиолетовым колпачком номер два. Аккуратно перемешайте содержимое, пипетируя в трубке пять-шесть раз.

Теперь поместите пробирку с фиолетовой крышкой на магнитный сепаратор и инкубируйте в течение 10 минут. Пока магнит еще на месте, перенесите примерно 1 миллилитр надосадочной жидкости в восстановительную пробирку с серой крышкой с помощью пипетки и тщательно перемешайте содержимое, пипетируя пробирку. Затем добавьте 100 микролитров изолированной суспензии естественных клеток-киллеров в автомобильную трубку и еще 100 микролитров в пробирку со стимулятором активации, или ASC.

Аккуратно перемешайте содержимое обеих пробирок с помощью вихревого миксера, чтобы обеспечить равномерное распределение. Инкубируйте трубки в нагревательном блоке или инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов Цельсия, в течение одного часа. Включите платформу LSIT.

Запустите программное обеспечение для захвата LSIT. Войдите в систему, введя свой идентификатор и пароль, затем выберите «Калибровать», чтобы запустить режим калибровки. Нажмите кнопку «Открыть» на сенсорном экране или используйте физическую кнопку раздвижной двери, чтобы открыть ящик.

Когда ящик откроется, снимите калибровочный слайд и уберите его на хранение. Теперь нажмите «Задать фон», чтобы откалибровать оптическую интенсивность. Установите на место калибровочный слайд в ящике и закройте ящик.

Затем нажмите «Начать калибровку», чтобы завершить процесс. Извлеките предметное стекло из мешочка. Пометьте его данными образца, прежде чем поместить его на чистую плоскую поверхность.

Пипетка 10 микролитров образца транспортного средства в каналы A и B, а затем пипетка 10 микролитров образца, стимулированного ASC, в каналы C и D. Теперь нажмите Open, чтобы извлечь ящик. Снимите калибровочный слайд и поместите его в ящик для хранения. Вставьте подготовленную предметку для анализа в ящик и нажмите кнопку «Закрыть», чтобы зафиксировать ее.

Вернитесь в главное меню и выберите «Активность и тест NK-клетки» на главном экране. Введите идентификатор образца или отсканируйте штрихкод, чтобы загрузить профиль образца. Затем нажмите кнопку Захват, чтобы начать запись изображения.

После захвата изображения нажмите «Анализ», чтобы начать обработку. Просмотрите процент активности NK-клеток и количество клеток, отображаемое на экране. Загрузите результаты на USB-накопитель или распечатайте их с помощью меню с сенсорным экраном.

Выберите «Подсчет и проверка ячеек» в главном интерфейсе LSIT. Загрузите 10 микролитров нового образца в канал для свежего предметного стекла с помощью пипетки. Вставьте горку в ящик.

Закройте ящик с помощью сенсорного экрана или кнопки и введите идентификатор образца в системе. Введите коэффициент разбавления на сенсорном экране, если применимо, и нажмите Подсчет, чтобы начать количественное определение ячеек. Просматривайте результаты, отображаемые на экране в виде ячеек на микролитр.

После анализа откройте ящик, нажав кнопку «Открыть» или переключив физический переключатель. Извлеките использованную горку из ящика руками в перчатках. Наконец, поместите калибровочный слайд обратно в ящик, чтобы защитить датчик, и закройте ящик с помощью сенсорного экрана или физического тумблера.

Платформа LSIT со встроенным программным обеспечением количественно оценивала активацию NK-клеток путем сравнения значений CSP активированных и нестимулированных контрольных клеток. Он предоставил отчет об иммунитете с обобщенной статистической таблицей. Стимуляция ASC вызывала явные морфологические изменения в NK-клетках, включая увеличение размера и цитоплазматической сложности, что наблюдалось у Hema 3-окрашенных Cytospins через 30 минут и два часа.

Теневые изображения показали, что ASC-стимулированные клетки имеют заметно более сложные дифракционные картины по сравнению с контрольными группами транспортных средств, с извлеченными параметрами, указывающими на увеличенное расстояние от пика до пика, цитоплазматическую зернистость и комбинированный параметр тени. Комбинированные значения теневых параметров позволили провести четкую классификацию между здоровыми донорами и онкологическими больными с минимальным перекрытием в распределении активированных и неактивированных NK-клеток в отдельных клетках. Здоровые доноры показали значительно более высокие значения индекса врожденного иммунитета, чем онкологические больные после стимуляции ИСС.