Обнаружение ДНК паразитов трипаносоматид и Nosema ceranae на месте с помощью щелочного лизиса в сочетании с системой RPA/CRISPR/Cas12a

Наши основные научные интересы сосредоточены на понимании механизма жизненных циклов передачи, а также на совершенствовании методов диагностики основных патогенов пчел, в том числе трипаносоматидных паразитов. Появление новых методов гидротермальных нуклеиновых кислот, которые обеспечивают экспоненциальную амплификацию нуклеиновых кислот при постоянных температурах, делает возможным обнаружение патогенов без необходимости в сложной инфраструктуре или лабораторном оборудовании. В нашей области идентификации и выбора молекулярных мишеней для обнаружения патогенов мы используем изотермическую RPA в сочетании с CRISPR-Cas12a для быстрой, чувствительной и портативной молекулярной диагностики.

Текущие задачи включают оптимизацию чувствительности и специфичности объекта, минимизацию ложноположительных результатов, упрощение подготовки образцов и разработку ролей, развертываемых, диагностических, адаптируемых к различным патогенам и условиям. Мы обратили внимание на потребность в быстром, простом и адаптируемом к конкретным условиям методе обнаружения патогенов медоносных пчел, преодолевая ограничения традиционной молекулярной диагностики. Для начала приобретите медоносную пчелу под наркозом.

Стерильным скальпелем рассекаем брюшко пчелы. Переложите рассеченную ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в пробирку 400 микролитров буфера HotSHOT, затем с помощью одноразового пестика тщательно промацерируйте ткань.

Сделайте трубку вихревой для дальнейшей гомогенизации тканей. Далее инкубируйте трубку в нагревательном блоке, установленном на 95 градусов Цельсия, в течение 10 минут для лизирования клеток. После инкубации переложите трубку сразу на лед для остывания.

Нейтрализуйте реакцию 400 микролитрами 40 миллимолярного трис-HCL, в результате чего конечная концентрация 20 миллимолярных трис-HCL в растворе. Для изотермической амплификации с помощью RPA сначала приготовьте исходную смесь в соответствии с количеством необходимых реакций. Используйте воду, обработанную диэтилпирокарбонатом, вместо готового к амплификации лизиса клеток для отрицательного контроля и ДНК патогена для положительного контроля.

Перелейте 46,5 микролитров мастер-смеси в 0,2 миллилитровые ПЦР-пробирки. Добавьте ацетат магния и матрицу ДНК в колпачки каждой ПЦР-пробирки в соответствии с указанными объемами. Кратковременно центрифугируйте пробирки, чтобы перемешать и начать реакцию RPA.

Затем инкубируйте пробирки в термоамплификаторе при температуре 39 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы провести реакцию амплификации RPA. В качестве альтернативы можно инкубировать образцы с помощью пробирок Eppendorf без ДНК в термоблоке. Сначала приготовьте стоковый раствор CRISPR РНК объемом 100 микромоля.

Восстановите 10 наномолей лиофилизированной CRISPR РНК в 100 микролитрах воды, обработанной диэтилпирокарбонатом. Чтобы приготовить один микромолярный рабочий раствор, смешайте один микролитр из 100 микромолярного запаса с 99 микролитрами воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, в пробирке объемом 0,2 миллилитра. Для приготовления раствора фермента Cas12a разбавляют 100 микромолярный раствор до одного микромолярного рабочего раствора, смешивая один микролитр фермента с 99 микролитрами разбавителя, входящего в комплект.

Теперь приготовьте 100 микромолярный стоковый раствор зонда FAM, повторно взвесив его в одном микролитре воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, на один наномоль зонда. Для 10 микромолярного рабочего раствора смешайте 90 микролитров воды, обработанной DEPC, с 10 микролитрами 100 микромолярного запаса. Далее приготовьте реакционную смесь CRISPR, исключив ампликоны в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Вихревую суспензию хорошо перемешать, затем распределить по ПЦР-пробиркам. Теперь внесите пипеткой четыре микролитра ампликона RPA в каждую пробирку. Поместите пробирки в амплификатор, установленный на 37 градусов Цельсия, и инкубируйте в течение 120 минут, при этом флуоресценция регистрируется каждую минуту.

В качестве альтернативы можно инкубировать образцы с помощью пробирок Eppendorf без ДНК в термоблоке. В конце инкубации перенесите реакции в пробирки объемом 0,2 миллилитра для визуализации с помощью системы документирования геля. Чтобы обнаружить биотиновый зонд в тесте бокового потока, подготовьте компоненты теста потока в пробирке объемом 1,5 миллилитров.

После вортексирования раствора распределите его по ПЦР-планшету. Затем добавьте четыре микролитра ампликона в соответствующие лунки. Инкубируйте пробирки ПЦР при температуре 37 градусов Цельсия в течение 120 минут с помощью амплификатора или термоблока без считывания флуоресценции.

Затем переложите образцы в пробирки объемом 0,2 миллилитров. Затем добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров проточного буфера и по 10 микролитров реакционной смеси. Введите полоски ImmunoStrips и выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Считывайте результаты после 10 минут погружения. Амплификация рекомбиназной полимеразы обнаружила Lotmaria passim в 16 из 32 образцов медоносных пчел, в то время как количественная полимеразная цепная реакция выявила только 12 положительных результатов, демонстрируя более высокую чувствительность метода RPA. Предел обнаружения количественной полимеразной цепной реакции составил примерно 9,6 паразитов, как показывает кривая амплификации с наименьшим видимым сигналом.

Предел обнаружения амплификации рекомбиназной полимеразы в сочетании с CRISPR-Cas12a соответствовал QPCR, обнаруживая всего шесть пикограмм, соответствующих 96 паразитам.