Оценка влияния факторов SASP на пролиферацию раковых клеток с использованием сравнительного анализа трех различных методологий

Стареющие раковые клетки выделяют такие факторы, влияющие на соседние клетки. Мы представляем три модели in vitro для изучения эффектов паракрина и juxtacrine, управляемых SASP, на пролиферацию клеток HeLa, мониторинг импеданса в реальном времени и цифровой визуализации живых клеток, выявляющий эффекты старения и микроэкологических паракринов, выходящие за рамки традиционных анализов конечных точек. Для начала включите систему анализа ячеек в реальном времени перед засевом ячейки.

Запустить программное обеспечение RTCA версии 2.0. Нажмите кнопку X заметок и введите экспериментальные детали. Нажмите кнопку «Запланировать» и добавьте два шага для записи фонового режима и мониторинга размножения клеток каждые 15 минут в течение 72 часов.

Выберите первый шаг и нажмите «Играть». Вручную добавьте 50 микролитров полного материала в каждую ячейку обзора электронной пластины. Далее промыйте как стареющие, так и несенесцентные клетки HeLa пятью миллилитрами стерильной, предварительно подогретой PBS.

После аспирации добавьте один миллилитр предварительно подогретого 0,05% трипсина и инкубируете. Нейтрализуйте трипсин пятью миллилитрами полного DMEM с добавлением антибиотиков. Затем центрифугуйте клетки при 500 G при комнатной температуре в течение 10 минут.

После отброса супернатанта снова суспензируйте клеточные гранулы в пяти миллилитрах полного DMEM с добавлением антибиотиков. Теперь посеяйте несенесцентные клетки HeLa в каждую ячейку одной электронной пластины на 100 микролитров полного DMEM с антибиотиками. Разместите вид e-пластины в колыбели системы анализа ячеек в реальном времени, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности пластины в инкубаторе.

Выберите второй шаг и нажмите «Воспроизведение», чтобы начать измерение импеданса. Семенные клетки в вставной пластине содержат 60 микролитров полного DMEM с добавлением антибиотиков в трёх различных экспериментальных схемах. Поддерживайте вставку e-plate при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислого газа в течение шести часов для крепления.

Нажмите «Пауза» после шести часов засевания клеток, затем аккуратно аспирируйте культурную среду из каждой ямы e-пластины, чтобы удалить сывороточные и неприлипающие клетки. Промыйте колодцы дважды с предварительно подогретым PBS при 37 градусах Цельсия. Добавьте 140 микролитров DMEM без сыворотки в каждую ячейку изображения электронной пластины.

Снимите медиум. Промыйте вставку для электронных пластин с помощью PBS, затем добавляйте 60 микролитров DMEM без сыворотки. Теперь разместите вставку e-пластины в вид e-plate.

Аккуратно нажимайте, пока вкладыш не будет полностью засеян в колодце. Вставьте объединённую пластину в систему анализа ячеек в реальном времени. Нажмите «Воспроизводить», чтобы возобновить мониторинг значений ячеек с интервалом в 15 минут с помощью программного обеспечения.

Нормализовать значения индекса ячеек в момент момента, когда вид e-пластины и вставка e-plate объединяются и вставляются в систему анализа ячеек в реальном времени. Далее нажмите кнопку «Анализ данных», чтобы рассчитать скорость и количество пролиферации, используя максимальный индекс ячеек и данные о наклоне, полученные из системы анализа ячеек в реальном времени. Затем проанализируйте данные с помощью соответствующей статистической программы.

Аспирируйте культурную среду из обеих шести-колодцевальных пластин, содержащих стареющие и нестареющие клетки HeLa. Промыйте клетки дважды с предварительно подогретым PBS при 37 градусах Цельсия, чтобы удалить остатки сыворотки и остатки клеток. Добавьте в каждую скважину два миллилитра среды DMEM без сыворотки с антибиотиками, затем инкубируете клетки в увлажнённом инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 48 часов.

Соберите кондиционированную среду из каждой скважины в стерильные трубки в ламинарном защитном шкафе. Центрифугировать собранную кондиционированную среду при 1000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия для удаления клеточного мусора, затем центрифугировать при 10 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы получить очищенный супернатант. Затем центрифугуйте кондиционированную среду с помощью двухмиллилитровых ультрацентробежных фильтров при 4 градусах Цельсия в течение 60 минут при 3000 г, чтобы сконцентрировать до 400 микролитров.

Разведите полученный концентрат свежей безсывороточной средой, чтобы приготовить 1x, 2x и 3x концентрированную кондиционированную среду в стерильных трубках в ламинарной камере безопасности. Когда клетки прикрепятся, аккуратно аспирируйте культурную среду из каждой ямы e-plate view, чтобы удалить сывороточные и неприлипающие клетки, и промывайте с помощью PBS. Затем пипетка на 200 микролитров предварительно нагрела кондиционированные среду при 37 градусах Цельсия в каждую группу.

Вставьте вид e-plate в систему анализа ячеек в реальном времени и нажмите «Воспроизойти», чтобы возобновить мониторинг индексов ячеек с интервалом в 15 минут в течение 48 часов. Посеять клетки на микрослайде под тремя экспериментальными установками и инкубировать при 37 градусах Цельсия в увлажнённой атмосфере с 5% углекислого газа. После восьми часов прикрепления промой клетки дважды с предварительно подогретым PBS при 37 градусах Цельсия.

Добавьте в каждую скважину по 200 микролитров безсывороточного Dulbecco's Modified Eagle's Medium. Включите контроллер температуры 2002-2 и установите его на 37 градусов Цельсия. Включите CO2-Controller 2000 и установите на 5% углекислого газа.

Включите источник флуоресцентного света. Поставьте затвор в инкубационную камеру на верхней части сцены. Запустите программное обеспечение на компьютере.

Выберите цель на 20 раз. Добавьте фазовый контрастный канал и флуоресцентный FITC-канал. С помощью контроллера сцены отмечайте позиции для каждой точки.

Установьте интервал времени на 30 минут, а длительность получения — на 48 часов, затем начните процесс захвата. Подсчитайте зеленые флуоресцентные белок-положительные клетки в обеих временных точках и рассчитывайте процент прироста для анализа. Лечение доксорубицином значительно индуцировало старение клеток в клетках HeLa.

Количественная оценка SA-бета-гал-положительных клеток показала значительно более высокий процент в группе, обработанной доксорубицином, по сравнению с контрольной группой. В первом подходе несенесцентные HeLa-клетки, сокультивируемые со стареющими HeLa-клетками, демонстрировали значительно более высокую скорость и ёмкость пролиферации по сравнению с клетками, кокультивируемыми с несенесцентными HeLa-клетками. Кондиционированные среды, полученные из устаревших HeLa-клеток в концентрациях 2x и 3x, значительно увеличивали скорость пролиферации и емкость несенесцентных HeLa-клеток по сравнению с кондиционированными средами несенесцентных клеток.

В третьем подходе, после 48 часов совместной культуры, клетки HeLa положительных с GFP показали значительно большее увеличение пролиферации при совместном культивировании со стареющими клетками HeLa по сравнению с несенесцентными кокультурными или только GFP-контролями.