Выявление электромеханического управления тканевым гомеостазом с помощью двухслойного микрофлюидного устройства

Мы применяем управляемые электрические поля для изучения того, как ткани реагируют на электрические сигналы, уделяя особое внимание тому, как токи или поля регулируют адгезию, пролиферацию и экструзию клеток, влияя на гомеостаз тканей. Мы обнаружили, что направление физиологически значимых токов диктует состояние тканей. Апикальное базальное поле индуцирует пролиферативный фенотип, в то время как базальное апикальное поле способствует экструзии клеток, позволяя модулировать общую плотность клеток.

В то время как количественные биоэлектрические исследования уже давно сосредоточены на миграции через гравитаксис, тканевый гомеостаз остается недоступным. Наша система теперь позволяет напрямую исследовать то, как физиологические картонные упаковки регулируют организацию и поддержание тканей. Наш протокол включает в себя микрофлюидологию, электрическую стимуляцию тканей, структурную и силовую микроскопию, а также визуализацию в реальном времени для изучения электромеханического контроля гомеостаза тканей.

В нашей работе были выявлены основные правила электромеханической связи. С помощью новых инструментов мы теперь можем исследовать, как возникают естественные биоэлектрические паттерны и регулируют ткани, и можем ли мы контролировать сложное поведение тканей, настраивая эти электромеханические сигналы. Для начала нанесите чистый слой на одну форму из полидиметилсилоксана или PDMS лицевой стороной вверх на чистую пластиковую крышку посуды и медленно добавьте 500 микролитров жидкого ультрафиолетового отверждаемого клея на форму.

С помощью шпателя тщательно намочите все выступающие конструкции и удалите все пузырьки воздуха, образовавшиеся в процессе смачивания. Аккуратно прижмите защитное стекло к форме PDMS и с помощью лабораторного стеклоочистителя удалите излишки отверждаемого ультрафиолетовым клеем, следя за тем, чтобы верхняя сторона защитного стекла оставалась чистой и плоской. Частично отверждайте конструкцию под равномерным воздействием ультрафиолетового света с длиной волны от 363 до 370 нанометров.

Сотрите все следы с помощью 75% этанола. Затем прочно удерживайте конструкцию на ровной поверхности и медленно отклеивайте форму PDMS от отвержденного слоя. Затем положите чистый слой двумя формами PDMS лицевой стороной вниз на плоскую плиту PDMS толщиной более 2,5 миллиметров.

Аккуратно постучите пинцетом по элементам формы сверху. Обратите внимание на интерфейс под элементами на предмет затемнения или оптического контраста, который подтверждает правильный контакт. Теперь заполните пространство между формой PDMS и плитой жидким ультрафиолетовым отверждаемым клеем капиллярного действия.

Частично отверждайте конструкцию под воздействием ультрафиолета в течение 10 секунд, как было продемонстрировано ранее. С помощью мягкого пинцета аккуратно снимите композитный отверждаемый ультрафиолетом клеевой слой и форму PDMS с плиты PDMS. При необходимости острыми ножницами обрежьте лишние края отвержденного клеевого слоя.

Затем поместите первый слой, прикрепленный к прямоугольному стеклянному покровному листу на плоскую поверхность. Совместите второй слой, все еще прикрепленный к форме PDMS, с первым слоем и плотно прижмите оба слоя друг к другу, пока под элементами не появятся тени. Отверждите выровненную структуру под ультрафиолетовым светом в течение 10 секунд, чтобы соединить первый и второй слои в двухслойный микрофлюидный чип, затем аккуратно снимите форму PDMS со склеенного чипа.

Немедленно нанесите пипеткой 10 микролитров раствора полиакриламидного гелевого прекурсора на середину участка ткани непосредственно над щелью во втором слое. Аккуратно надавите на каплю круглый стеклянный покровный лист диаметром 10 миллиметров, чтобы получился плоский гель. Наблюдайте, как раствор геля течет в первый слой через щель, и остановитесь у ряда барьерных столбов.

Немедленно отверждайте собранный микрофлюидный чип под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. Затем оставьте чип в покое примерно на один час, чтобы полиакриламидный гель полностью застыл. Затем инкубируйте микрофлюидный чип в 0,1-молярном буфере HEPES при pH 7,4 в течение не менее одного часа, чтобы гидратировать гель и уменьшить адгезию между гелем и покровным стеклом.

Затем аккуратно с помощью острого пинцета удалите покровную соскальзывание с поверхности геля. Поместите картридж из медицинского поликарбоната на ровную поверхность нижней стороной вверх и совместите высушенный чип лицевой стороной вниз с картриджем. Пипеткой нанесите УФ-отверждаемый клей в щели между чипом и картриджем, заполнив их с помощью капиллярного эффекта, и отверждите под воздействием ультрафиолетового света.

Стерилизуйте изготовленные микрофлюидные устройства, поместив их под ультрафиолетовый свет на глубине от 200 до 280 нанометров внутри шкафа биобезопасности. Приготовьте необходимый объем 50 мкг на миллилитр коллагена один рабочий раствор в 1Х ДПБС на льду. На льду приготовьте рабочий раствор Sulfo-SANPAH, разбавив два микролитра стокового раствора Sulfo-SANPAH, предварительно растворенного в безводном диметилсульфоксиде, в 80 микролитрах холодного 0,1 молярного буфера HEPES при pH 7,4, хранящемся при четырех градусах Цельсия.

Промокните края полиакриламидного геля лабораторными салфетками, чтобы высушить его внутри устройства. Нанесите пипеткой 80 микролитров рабочего раствора Sulfo-SANPAH на поверхность геля, обеспечивая полное погружение, и поместите чип под ультрафиолетовое излучение на пять минут, чтобы активировать Sulfo-SANPAH. Промойте гель три раза холодным 0,1 молярным буфером HEPES при pH 7,4.

Повторите обработку препаратом Сульфо-САНПА, пипетируя 80 микролитров рабочего раствора SS над гелем и облучая его под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. На этот раз смойте гель три раза холодным 1X DPBS. Наконец, нанесите пипеткой 100 микролитров коллагенового раствора на полиакриламидный гель, обеспечивая полное покрытие, и оставьте на один час.

Смойте неприкрепленный коллаген с помощью 1X DPBS три раза, затем оставьте гель погруженным в 1X DPBS до дальнейшего использования. Крепите устройства к вставкам с помощью саморезов. Затем закрепите до четырех сборок вставок прибора на держателе, предназначенном для установки на предметный столик микроскопа.

Добавьте по два миллилитра питательной среды в каждую основную лунку устройств и через каналы удаления отходов для промывки и замены 1X DPBS. Затем вставьте платиновые электроды в трубку, содержащую 45 миллилитров среды, убедившись, что они полностью погружены в среду. Протяните питательную среду через трубку Tygon с помощью шприца и плотно зафиксируйте ее.

Подсоедините один конец трубки со средним заполнением к электродной камере, а другой конец — к устройству. Теперь приготовьте клеточную суспензию, следуя рекомендациям по трипсинизации или приготовлению клеточной суспензии, и засейте 0,1 миллиона клеток в основную лунку. Установите установку на микроскоп так, чтобы электродные камеры располагались по бокам, и подключите источник-измеритель к электродной камере.

Используйте три устройства с одинаковым сопротивлением канала. Назначьте одну из них в качестве контрольной группы. Подайте апикальный к базальному току ко второму устройству и базальный ток к апикальному к третьему устройству.

Подавать электрический сигнал в режиме токовых клещей и подавать общий ток 20 микроампер. Выберите объектив 20X для визуализации всей ткани с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Наконец, выберите канал 561 для красной флуоресценции и светлопольных каналов.

Выберите один часовой интервал времени во время длительной визуализации. Электростимуляция применялась перпендикулярно клеткам для нарушения трансэпителиального потенциала для изучения его роли в поведении тканей при различных направлениях тока. При фазово-контрастной визуализации, апикально-базальные, или АТБ-токи, вызывали осветление клеточных соединений в течение 10 минут после нанесения, в то время как в контрольных и базально-апикальных условиях, БТА, наблюдался низкий контраст и плоские апикальные поверхности.

Токи ATB создавали внешнюю выпуклость на поверхности апикальной ячейки. Деформация геля сильно зависела от направления тока. Токи ATB тянули гель вверх, в то время как токи BTA сжимали гель вниз.

Интенсивность переходного Е-кадгерина увеличивалась под действием токов ВТА, но значительно снижалась под действием токов АТБ по сравнению с контролем. Интенсивность переходного актина снижалась под действием токов АТБ, но достоверно не увеличивалась при токах ВТА по сравнению с контролем. Токи АТБ запускали многоклеточные экструзии живых клеток через монослой, в то время как токи ВТА сохраняли структуру монослоя, аналогичную контролю.

Пространственная гетерогенность в распределении клеток была значительно выше при токах ATB, но оставалась низкой и равномерной в BTA и контрольных условиях. Скорость пролиферации клеток увеличивалась при стимуляции ATB, с более высокими скоростями деления с течением времени. Напротив, токи БТА индуцировали больше случаев гибели клеток.