Вскрытие черепно-лицевых тканей данио-рерио при окрашивании альцианским синим

Мы изучаем механизмы, с помощью которых вкус рыбок данио растет с течением времени, используя фиксированные образцы, а также покадровую визуализацию эмбрионов с высоким пространственным временным разрешением с помощью световой листовой микроскопии. Наш протокол прост и удобен для выполнения. В нем подробно изложены шаги по препарированию и отделению черепно-лицевых хрящей пятидневной личинки данио-рерио.

Этот протокол позволил тщательно охарактеризовать форму нёба на тканевом и клеточном уровнях, что в конечном итоге позволило нам оценить влияние комментарных антигенов на морфогенез нёба. Для начала возьмите от 20 до 25 личинок рыб данио, находящихся под наркозом, и удалите анестетик, как только личинки перестанут двигаться. Добавьте в пробирку 1,5 миллилитра 4%-ного параформного альдегида, и поместите образец на качалку, установленную на 60 оборотов в минуту при комнатной температуре на два часа.

С помощью пипетки удалите из трубки как можно больше фиксатора. Затем добавьте в пробу 1,5 миллилитра 50% этанола, и поместите его на коромысло при комнатной температуре, установленной на 60 оборотов в минуту, на 10 минут. Теперь с помощью пипетки отсадите этанол из пробирки, и добавьте к образцу 1,5 миллилитра раствора красителя альцианского синевы.

Инкубируйте личинки в растворе пятила от 18 до 20 часов при комнатной температуре, покачиваясь со скоростью 60 оборотов в минуту. Далее удалите раствор пятна с помощью пипетки, и промойте личинки 1,5 миллилитрами дистиллированной воды в течение одной-двух минут на коромысле комнатной температуры. Затем добавьте к образцу один миллилитр раствора хлорной извести, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут, не накрывая пробирки.

С помощью пипетки удалите раствор отбеливателя из образца и обработайте образец первым и вторым растворами для очищения тканей. После удаления второго раствора добавьте к образцу от 1,5 до двух миллилитров накопительного раствора. Из-за содержания глицерина наблюдайте, как окрашенные образцы постепенно опускаются на дно в течение 10 минут.

Поместите окрашенную личинку на ее боковой стороне в чашку Петри, покрытую агарозой. С помощью щипцов аккуратно соскребите желток с тела личинок. После удаления желтка перенесите личинок в свежую чашку Петри, чтобы избежать помех при вскрытии, держите личинок возле задней части головы с помощью одной пары щипцов.

С другой парой аккуратно удалите глаза, не повреждая окружающие черепно-лицевые структуры. Удерживая личинку, все еще с помощью одной пары щипцов, сделайте разрез в центре ткани дорсально к нервному черепу. Затем ущипните и оттяните мозг и связанные с ним ткани.

Далее отделите голову личинок от остального тела. Полученная область головы должна включать в себя нейрочереп и висцеральный череп, все еще прикрепленный к переднему и заднему концам. Осторожно разрежьте две точки соединения между нейрочерепом и висцеральным черепом с помощью щипцов, чтобы полностью разделить их.

Наконец, поместите одну или две капли 100% глицерина на чистое предметное стекло и перенесите рассеченный нейрочереп или висцеральный череп на предметное стекло. С помощью щипцов аккуратно положите покровное стекло поверх салфеток, убедившись, что пузырьки воздуха не задерживаются, и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей перед визуализацией. Рассеченный нейрочереп показал несколько четко помеченных структур, включая решетчатую пластину, трабекулу и перикардиальный хрящ, что позволило провести детальный структурный анализ.

Висцеральный череп включал в себя хрящ Меккеля и дополнительные элементы, такие как небная квадратура и бильжаберные хрящи. Окрашивание альцианским синим через пять дней после оплодотворения позволило четко визуализировать решетчатую пластину. Ширина и длина решетчатой пластины были последовательно измерены с помощью анализа изображений, а длина была значительно больше ширины, и количественные данные из 15 образцов.

Площадь решетчатой пластины была извлечена из данных изображений и подтверждена количественной оценкой с четкими граничными обозначениями. Отчетливое клеточное расположение наблюдалось в решетчатой пластинке с кубовидными клетками в медиальной области и клетками колумера в боковых частях. Окрашивание Dappy позволило визуализировать отдельные ядра клеток в пределах решетчатой пластинки.