Мутагенез на основе CRISPR-Cas9 у энтомопатогенного нематода Steinernema hermaphroditum и поддержание мутантных линий

Мы работаем над генетикой симбиоза бактерий нематод, которая имеет применение в сельском хозяйстве. Генетические инструменты у бактерий Xenorhabdus очень хорошо развиты, но генетика ЭПН остаётся ограниченной, в основном опираясь на РНКи и скрининги EMS. Для начала приобретите нематодные агарные пластины, засеянные Xenorhabdus griffiniae и Comamonas aquaticus.

Выберите нематод Steinernema hermaphroditum на подготовленные пластины NGM, содержащие Xenorhabdus griffiniae. Инкубировать их при 25–28 градусах Цельсия для оптимального роста. Накануне микроинъекции собирайте гермафродитов стадии J3 на свежие тарелки НГМ-агара, засеянные Xenorhabdus griffiniae.

В день микроинъекции выбирайте молодых взрослых гермафродитов для инъекций. Извлеките целевую последовательность гена из эталонного генома Steinernema hermaphroditum с помощью BlastP. Выберите ранний кодирующей экзон, желательно первый, и введите последовательность в CRISPRscan с использованием стандартных настроек для генерации кандидатных РНК CRISPR.

Сравните лучшие кандидаты РНК CRISPR с геномом Steinernema hermaphroditum, чтобы избежать совпадений с точки зрения. Храните выбранные РНК CRISPR и универсальные транс-активирующие РНК CRISPR при 100 микромолярах каждая в дуплексном буфере при минус 80 градусах Цельсия. Растопите 2% агарозы в воде с помощью микроволновки.

Перелейте 50 микролитров расплавленной агарозы на стекло для крышки. Сразу же накройте его вторым крышным стаканом. После 20 минут сушки снимите стекло с верхней крышки, затем наклейте переднюю сторону агарозной подушечки.

Храните прокладки агарозы при комнатной температуре для длительного использования от месяцев до нескольких лет. Чтобы подготовить иглы к введению, вытяните кварцевые капилляры на лазерный натяжитель и храните иглы в ящике для пипетки. Подготовьте свежие дуплексы направляющей РНК, смешивая выбранные crРНК и универсальные транс-активирующие CRISPR РНК в соотношении один к одному.

Инкубировать трубку при 94 градусах Цельсия в течение двух минут, затем охладить до комнатной температуры до отжигающих дуплексов. Собрать инъекционную смесь, объединив Cas9, хлорид калия и дуплексы gRNA и инкубировать. Переключите ПЦР-трубку три раза для смешивания, затем ненадолго покрутите 10–15 секунд в мини-центрифуге.

После финального смешивания вращайте до одной минуты, чтобы собрать содержимое. Затем используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы загрузить в иглу от одного до двух микролитров инъекционной смеси. Закрепите иглу на держателе, разломите кончик, проведя по двусторонней ленте под галоуглеродным маслом.

И проверьте размер отверстия с помощью чистой функции микроинжектора. Положите небольшую каплю галоуглеродного масла на 2%агарозную площадку. С помощью расчленённого микроскопа и мягкой платиновой проволоки поднимите молодого взрослого гермафродита.

Помой его в буфере M9, чтобы удалить бактерии. Перенесите нематоду на агарозную подушечку и поместите её в каплю галоуглеродного масла. Используйте мягкую платиновую проволоку, чтобы аккуратно прочесать нематоду, пока она не обездвижится.

Установьте площадку на стадии микроинъекции. Найдите одну гонадную руку и проткните её иглой. Используйте чистую функцию инжектора, чтобы подать инъекционную смесь при давлении 99 фунтов на квадратный дюйм, пока не станет видим гонадальный поток, что подтверждает доступ реагента к синцитию.

Если доступно, переместите ступень и введите вторую гонадную руку аналогичным образом. Сразу после инъекции суспензировать введённое животное в один-два микролитра буфера M9 на агарозной подушечке. Используйте тонкий платиновый провод, чтобы снять введённого червя с площадки, затем смойте масло буфером M9 и перенесите его на пластину восстановления NGM, засеянную Comamonas aquatica.

Инкубируйте восстановительную пластину при 25 градусах Цельсия на ночь. На следующий день изолируйте каждую введённую нематоду P0 на отдельные пластины NGM, засеянные Xenorhabdus griffiniae. Были разработаны две РНК CRISPR, направленные на гомолог Steinernema hermaphroditum unc-22 на ранее опубликованных PAM-сайтах.

Анализ нематод, подвергшихся воздействию никотина, показал явные различия в движении между мутантами unc-22 и нематодами дикого типа. Генотипирование дергающихся потомков с помощью ПЦР показало несколько слабых полос на целевом участке как для Pam 3, так и для Pam 5. Секвенирование подтвердило события вставки и удаления на целевом участке UNC-22.

Моя лаборатория расширила мою постдокторскую работу по генетике EPN. CRISPR теперь доступен у трёх видов Steinernema. В этом протоколе мы разработали эффективную технику создания стабильных наследственных мутантов с помощью редактирования генов CRISPR-Cas9.

При стабильном редактировании гена CRISPR-Cas9 мы можем разобрать молекулярные механизмы, лежащие в основе симбиоза Steinernema-Xenorhabdus.