Анализ фосфолипидного оттока липопротеинов высокой плотности

Мы разработали суррогатный тест для измерения удаления липидов коронарных бляшек с помощью ЛПВП с целью оценки риска ишемической болезни сердца. Текущая задача — разработать простой, быстрый и надёжный анализ на приток липидов ЛПВП как для научных, так и для клинических применений. Для начала добавьте всё необходимое содержимое в стакан под химическим вытяжком и ненадолго закрутите липидную смесь для смешивания раствора.

Сушите смесь в стеклянной трубке под мягким струёй азота в течение часа, чтобы на дне трубки образовалась сухая липидная пленка. Для покрытия гидрата силиката кальция вставьте бумажный конус в стеклянную трубку с высохшими липидами и добавьте 80 миллиграммов порошка гидрата силиката кальция, используя конус для направления порошка к основанию. Сразу же добавьте 2 миллилитра физиологического раствора в тюбик и накройте верх парапленкой.

Закрутите стеклянную трубку вручную, чтобы убрать основную часть липидов снизу. Вставьте стеклянную трубку в отверстило, сделанное в пенопластовой платформе, прикреплённой к вихрю, и закрепите её на платформе с помощью армированной ленты. Проведите вихрь стеклянной трубки на 10 минут и убедитесь, что липидов на стенке трубки не осталось.

Перенесите содержимое стеклянной трубки в 15-миллилитровую коническую пластиковую трубку с помощью пипетки объёмом 1 миллилитр. Промыйте стеклянную трубку 3 миллилитрами физиологического раствора и перелейте стирку в ту же 15-миллилитровую трубку. Далее поместите пластиковую трубку объемом 15 миллилитров с гипидным гидратом силиката кальция в центрифугу и открутите при 935G в течение 2 минут при 4 градусах Цельсия.

Используйте длинный и тонкий наконечник пипетки для аспирации супернатаната. Начиная с верхней части супернатанта, медленно скользите кончиком пипетки по боковой стороне трубки во время аспирации. Слегка наклоните трубку во время аспирации и оставьте примерно 200 микролитров физиологического раствора над гранулой, чтобы не нарушать её.

Затем добавьте физиологический раствор, чтобы увеличить общий объём до 5 миллилитров. Повторите центрифугирование и удаление супернататора четыре раза. После финальной промывки добавьте физиологический раствор, чтобы увеличить общий объём до 2,5 миллилитров Pipette 75 микролитров физиологического раствора в каждую скважину пластины объемом 0,3 миллилитра на 96 лунок в зависимости от количества колодц, необходимых для пробного набора.

Вихрь пластиковую трубку объёмом 15 миллилитров с LC-CSH три раза по 10 секунд каждая. С помощью пипетки с одной скважиной наносят 50 микролитров LC-CSH вдоль правой стороны солёных скважин. После трёх колодцев повторите протокол вихря перед тем, как вводить в следующие три колодца.

Поверните пластину с 96 скважинами на 180 градусов так, чтобы левая сторона скважин теперь была вправо. Пипет, 25 микролитров образцов плазмы или сыворотки вдоль правой стороны каждой ямы. Для положительных контрольных скважин добавьте 25 микролитров стандартной человеческой нормальной липидемической плазмы или сыворотки.

Далее плотно запечатайте пластину на 96 лунок клейкой пленкой и инкубуйте её в темноте в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия и 1 200 оборотах в минуту в термомиксере. После инкубации снимите пластину из термомиксера и положите её на лёд. Центрифугуйте пластину в течение двух минут при температуре 935G при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать донорские частицы и остановить реакцию переноса.

Теперь аккуратно удалите клейкую плёнку с пластины на 96 ярок, не трогая гранулу LC-CSH. Пересадите 50 микролитров супернатанта из реакционной пластины в колодцы черной полистироловой пластины с плоским дном на 96 лунок с использованием многоколодной пипетки. Наполните резервуар обычным физиологическим раствором и добавьте в каждую скважину 50 микролитров физиологического раствора.

с помощью многоколодцевой пипетки. Приготовьте 1% Triton X-100 в пластиковой колбе Erlenmeyer объёмом 125 миллилитров. Наполните резервуар подготовленным 1%Triton X-100 и добавьте в каждую скважину 100 микролитров того же раствора комнатной температуры.

Перемешивайте, аккуратно двигая трубку вверх и вниз два-три раза с помощью пипетки с несколькими лунками и лопайте любые пузырьки воздухом из 3-миллилитровой трансферной пипетки. Наконец, измерьте флуоресценцию лиссамина родамина с помощью флюорометра с возбуждением 540 нанометров и излучением 600 нанометров. Стандартная кривая была сгенерирована с использованием серийно разбавлённого LRHPE с маркировкой LC-CSH и показала высоколинейный флуоресцентный ответ.

В исследовании кривой концентрации плазмы увеличивающиеся объёмы объединённой человеческой плазмы подавали в тройные скважины наряду с солёными контрольными растворами. Кривая отклика дозы плазмы показала отличную линейность между ПЭ, афлюксом и объёмом плазмы с сильной корреляцией в диапазоне 15-35 микролитров. Наш простой и быстрый протокол, предсказывающий риск сердечно-сосудистых заболеваний, может использоваться как для исследований, так и для клинических диагностических исследований.

Наши результаты показывают, что наш анализ может прояснить роль как клеточных, так и внеклеточных липидов бляшек в сердечно-сосудистых заболеваниях.