Визуализация кальция in vivo и ex-vivo нейроном обонятельной цепи личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

В этом протоколе используется тканевый клей GLUture для улучшения способности визуализации кальция in vivo и ex-vivo. Это позволяет исследователям понять динамику кальция в нейронах обонятельной цепи у личинок дрозофилы третьего возраста. Простота и экономичность являются двумя основными преимуществами этого метода, что делает эксперименты более надежными и доступными в нейрофизиологических исследованиях.

Подготовьте две камеры кормления, поместив в шестисантиметровые чашки Петри небольшой квадрат из химиотерапии. Для голодающих условий добавьте 350 микролитров дистиллированной воды. Для не голодающих условий добавьте 350 микролитров 0,2 молярного раствора сахарозы.

Перенесите равное количество промытых личинок в каждую камеру кормления. Дайте личинкам питаться сахарозой, не голодающей, или дистиллированной водой, голодающими, в течение двух часов при комнатной температуре На покровном стекле микроскопа размером 24 на 50 миллиметров, толщиной 1,5 миллиметра, создайте лунку, используя вазелин, дозированный из шприца. Нанесите небольшую каплю клея GLUture для местного применения в центр покровного стекла.

Равномерно распределите GLUture тонким равномерным слоем с помощью стеклянного стержня. Осторожно перенесите одну личинку на GLUture с помощью щетки или тонкой проволоки. Аккуратно прижмите брюшную сторону личинок к клею.

Дайте GLUture высохнуть, убедившись, что личинки полностью обездвижены. После того, как личинки будут обездвижены, погрузите личинку в 100 микролитров буфера для визуализации. Поместите защитное стекло на инвертированный микроскоп Leica DMi8, подключенный к модулю конфокального сканера Yokogawa CSU-W1 с вращающимся диском и ПЗС-камерой для визуализации кальция.

Подготовьте покровное стекло микроскопа с помощью GLUture для визуализации кальция, как описано в шагах с 3.2 по 3.3. Завершите вскрытие, как описано в Ishimoto and Sano, 2018. С помощью микропипетки-10 осторожно аспирируйте рассеченный мозг пятью микролитрами диссекционного раствора из чашки Петри.

Медленно выводите мозг на GLUture. Прежде чем GLUture высохнет, ориентируйте мозг в положение тыльной стороной вверх так, чтобы две доли мозга были обращены вниз, а дорсальный вентральный канатик — вверх. С помощью микропипетки P-200 перенесите 100 микролитров буфера для визуализации кальция на мозг иммобилизованной личинки на покровное стекло.

Откройте VisiView для визуализации кальция с помощью инвертированного вращающегося микроскопа Leica DMi8. Снимайте изображения с помощью 10X/1.4 любого объектива с фильтрами, переключаясь между лазером GFP и RFP-лазером. Значения экспозиции находятся в диапазоне от 100 до 1000 миллисекунд, а усиление устанавливается на уровне 50% от соответствующего значения экспозиции.

Во время захвата изображения применяется коэффициент ставки, равный двум. Определите интересующий нейрон путем поиска сигнала tdTomato с помощью RFP-лазера. После того, как интересующая область определена, переключитесь на лазер GFP для захвата сигналов GCaMP6f.

Убедитесь, что сигналы tdTomato и GCaMP разговаривают друг с другом, прежде чем захватывать изображения стека обоих каналов. Захватите две отдельные записи временных рядов сигналов об успешном выполнении tdTomato и GCaMP6f одновременно со скоростью 0,5 кадра в секунду в общей сложности в течение двух минут. Импортируйте стеки сигналов tdTomato и GCaMP6f в ImageJ.

Чтобы определить правильную область интереса, объедините сигналы tdTomato и GCaMP6f для подтверждения колокализации. После проверки разделите каналы tdTomato и GCaMP6f. Импортируйте пользовательские макросы на основе ROI в ImageJ.

Выберите стек GCaMP6f и нажмите кнопку «Выполнить» для анализа кальция. Макрос сначала генерирует проекции максимальной интенсивности, выполняет коррекцию движения с помощью плагина stack reg и применяет коррекцию отбеливания. Коррекция движения проводилась путем определения широкой прямоугольной области интереса, такой как доля мозга на каждом кадре.

Прямоугольная рамка должна покрывать всю окупаемость инвестиций во всех кадрах, чтобы обеспечить точную коррекцию движения, сохраняя при этом локальную, пространственную форму и форму ROI во всех кадрах. Каждый ROI, макросы вычисляли единицу, интенсивность по всем кадрам, два, базовую разницу в колебаниях, такую как разница между максимальными и минимальными значениями интенсивности в течение первых 10 кадров, и в-третьих, максимальное изменение интенсивности от кадра к кадру, дельта F. ROI, показывающие колебания интенсивности менее 10 единиц, были исключены. Окончательный набор данных был разделен на четыре столбца: один — время и кадры, второй — выборка условий голодания или кормления, три идентификатора реплики — отдельные образцы и четыре — нормализованная интенсивность.

Значение нормы F масштабируется от нуля до единицы. Наконец, анализ и визуализация данных были выполнены в R с использованием пользовательских скриптов R. Необходимые пакеты, включая ggplot2, dplyr и readr, были установлены и обновлены перед запуском анализа.

Выходные данные включали тепловые карты, иллюстрирующие нормализованную интенсивность кальция для первых 30 кадров, 60 кадров и всех кадров при записи временных рядов, а также диаграммы блокировок, показывающие медиану нормализованных интенсивностей. Значимость нормализованной интенсивности кальция оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. На первом рисунке показана схема кальциевой визуализации in-vivo и ex-vivo.

Целый образец личинки А, или образец мозга личинки В, был закреплен на тонком слое глютуры сплошного синего цвета, разложен в лунке с вазелином и закруглен на защитном стекле микроскопа. Образцы погружали в буфер для визуализации кальция светло-голубого цвета и помещали для визуализации на конфокальный микроскоп с перевернутым вращающимся диском. Были получены временные ряды изображений флуоресценции кальция образцов.

Схема была подготовлена с помощью BioRender. На втором рисунке показана флуоресцентная визуализация GCaMP6f. A, разделенные изображения, показывающие флуоресценцию в канале 488 нм, GCaMP6f и зеленый, и канал 525 нм, tdTomato красным.

Объединенное изображение отображается на правой панели. B, пример кривых необработанной флуоресценции с течением времени для GCaMP6f зеленым цветом и tdTomato красным цветом в трапецеидальных LN. Флуктуации флуоресценции GCaMP6f указывают на активность кальция, в то время как стабильный сигнал tdTomato используется в качестве контроля для идентификации трапецеидальных LN.

C, репрезентативные изображения сигнала GCaMP6f для верхних панелей in-vivo и подготовки нижней панели ex-vivo. Образцы без голода показаны слева, а образцы без голода — справа. На третьем рисунке показаны измерения флуоресценции GCaMP6f.

A, на верхней левой панели показана тепловая карта, показывающая среднюю временную динамику сигналов кальция от ключевых элементов от личинок, не страдающих от голодания, N=5, и голодающих, N=5, в целых личинках, полученных в виде препарата in-vivo. Ящичковая диаграмма в верхней правой части сравнивает нормализованную интенсивность сигнала кальция между образцами без голодания в сером цвете и без голодания в белом цвете в препарате in-vivo. U-критерий Манна-Уитни, P меньше 0,001.

B, на нижней левой панели показана тепловая карта, показывающая динамику кальциевых сигналов от Keystone LN от Keystone LN у неумерших от голода, N=5 и истощенных N=5 в препарированном мозге ex-vivo. На ящичковой диаграмме в нижней правой части сравнивается нормализованная интенсивность сигнала кальция между образцами препарата ex-vivo, которые не испытывали голодания, серого цвета и испытывали голод белого цвета. U-критерий Манна-Уитни B меньше 0,001.

Чтобы продемонстрировать наш подход к визуализации кальция личинок, мы успешно применили его как к in-vivo, так и к ex-vivo препаратам личинок дрозофилы. В обоих препаратах мы наблюдали более высокую активность трапецеидальных трапецеидальных выбросов LN и образцов без голодания по сравнению с образцами, не испытывавшими голодание. Эти более высокие ключевые показатели активности были четко замечены на тепловых картах, демонстрирующих временные представления откликов в течение 60 секунд, и на ящичковых диаграммах, отображающих средние значения интенсивности сигнала.

Эти результаты согласуются с недавними исследованиями, которые демонстрируют более высокую активность обонятельных нейронов у голодающих животных. Как показано в этом видео, тканевый клей GLUture значительно уменьшает артефакты движения как в in-vivo, так и в ex-vivo. Этот метод также может быть применен для изучения различных видов стимулов, например, внешнего применения запахов и внутреннего суперфьюзии нейромодуляторов.