Оценка микробиологической безопасности молочных заводов с использованием бактериального протеомного профилирования с помощью подхода MALDI

Мы разработали протокол для подготовки и изоляции микробных сообществ из различных ежедневных продуктов, таких как молоко, сливки, масло и сыр. После изоляции этот микроорганизм можно быстро и точно идентифицировать с помощью MALDI-TOF MS. Оптимизация условий культурирования остаётся ключевой задачей, наряду с пробелами в базе данных и требовательной экстракцией грамположительных и спорообразующих бактерий. Для начала возьмите репрезентативный образец молочного продукта и тщательно перемешайте для обеспечения единообразия.

Асептично переместите один миллилитр или грамм твёрдых образцов в 15-миллилитровую коническую центрифугную трубку с девятью миллилитрами стерильной жидкой среды. Интенсивно закрутите трубку в течение 30–60 секунд для гомогенизации образца. Затем подготовьте серию десятикратных разбавлений, передав один миллилитр гомогенизированной суспензии в последовательные трубки, каждая из которых содержит девять миллилитров стерильного раствора.

Тщательно перемешайте каждое разбавление с помощью вихря или встряхивания. Затем возьмите 0,1 миллилитра исходного образца или одного из приготовленных растворов и переложите его на поверхность приготовленной чашки Петри с соответствующей агарной средой. С помощью стерильного распределителя равномерно распределите инокулум по поверхности агаровой пластины.

Для аэробной инкубации вакцинируйте агарные пластины APT, M17, CBL, MPCA и TSA с подготовленными образцами. Инкубировать пластины в аэробных условиях при 37 и 30 градусах Цельсия в течение 24 часов. Для анаэробной инкубации поместите инокуленные агарные пластины MRS в анаэробную камеру и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 30 градусах Цельсия в течение 24–72 часов.

Убирайте пластины из инкубатора и ежедневно изучайте их для мониторинга роста микроорганизмов. Используя микробную петлю объёмом один микролитр, разместите выбранные колонии на той же агарной среде для субкультуры. Инкубировать в тех же условиях, что и ранее.

Для масс-спектрометрического анализа начинайте с подготовки раствора матрицы MALDI. Приготовьте растворительную смесь с использованием 50% ацетонитрила, 47,5% воды HPLC и 2,5% трихлоруксусной кислоты. Растворите матричное соединение в растворительной смеси до конечной концентрации примерно 10 миллиграммов на миллилитр.

Для идентификации бактерий при РС с помощью метода прямого переноса колонии используйте стерильную петлю для переноса одного микролитра выращенной бактериальной колонии на участке на мишенной пластине MALDI. Распределите бактериальный материал, чтобы создать тонкий, ровный слой на пластине. После высыхания добавьте сверху один микролитр раствора матрицы HCCA и дайте высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Для целенаправленного метода экстракции муравьиной кислоты используйте одноразовую микробную петлю или стерильную зубочистку, чтобы собрать небольшое количество бактериальной биомассы из одной колонии. Нанесите материал непосредственно на место на мишенной пластине MALDI, чтобы получить тонкий ровный слой. Добавьте один микролитр раствора 70% муравьиной кислоты на размазанную область.

Когда пятно высохнет, наложите на него один микролитр раствора матрицы HCCA и дайте высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Для метода извлечения белка из трубки переместите от одной до трёх полных колоний из пластины для агарной культуры в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра с 300 микролитрами стерильной воды. Добавьте 900 микролитров абсолютного этанола для достижения конечной концентрации этанола примерно 75%. После короткого смешивания пробирку центрифугуйте в течение двух минут при 15 000 г при комнатной температуре.

После этого аккуратно сбросьте супернатант, не нарушая клеточную гранулу. Затем добавьте 20–50 микролитров 70% муравьиной кислоты в высушенную клеточную гранулу. Смешивайте содержимое с помощью пипета или вихря до полной суспензии гранулы.

Теперь добавьте равный объём ацетонитрила в суспензию муравьиной кислоты и тщательно перемешайте. Центрифугуйте трубку при 15 000 г в течение двух минут. Перенесите один микролитр получающегося супернатанта в определённое место на мишенной пластине MALDI и дайте ему высохнуть.

Затем засохшее пятно наложите один микролитр раствора матрицы HCCA. Пипетка — один микролитр либо стандарта бактериального теста, содержащего экстракт Escherichia coli DH5 alpha, либо микробиологический калибратор с экстрактом белка E.coli ATCC 25922, рибонуклеазой и миоглобином. Для получения спектров и микробной идентификации подготовьте калибровочные пятна на мишенной пластине MALDI.

Загрузите на мишенную пластину MALDI как подготовленные образцовые пятна, так и пятна калибра в масс-спектрометрический прибор. Запустите калибровочный анализ в режиме калибровки, чтобы откалибровать систему. Работа масс-спектрометра в линейном режиме положительных ионов для общего сбора спектров.

Затем установите диапазон массового обнаружения масс-спектрометра на соотношение массы к заряду от 2 000 до 20 000. Получите спектры в дублировании для каждой пятны, чтобы получить не менее четырёх технических реплик на образец. Теперь применим метод Савицкого-Голея как алгоритм сглаживания.

Используйте алгоритм TopHat для коррекции базовой линии, чтобы убрать фоновый шум. Затем обнаруживайте пики в центроидном режиме. Загрузите обработанные масс-спектры неизвестных бактериальных изолятов на платформу микробной идентификации в программном обеспечении MALDI и выполните идентификацию.

Оценивайте идентифицирующие оценки в соответствии с пороговыми стандартами производителя. Спектры масс-спектрометрии показывали специфические для каждого вида профили белков, что позволяло идентифицировать их на уровне рода или вида. Дендрограмма показала высокое сходство, наблюдаемое среди штаммов одного вида, и чёткое различие между видами.

Более короткое время инкубации в 12 часов для Bacillus licheniformis дало более высокое значение ID — 2,38, а более длительная инкубация — 18–24 часа, — к более низкому значению ID — 1,85 из-за доминирования споровых сигналов. Среди методов подготовки образцов экстракция белка из пробирки дала наивысшее значение ID — 2,23, затем экстракция муравьиной кислоты в целевую цель — 1,97, а также прямой перенос колоний, что дало наименьший балл 1,61. Сочетая культуромические методы с индивидуальной подготовкой образцов, MALDI позволяет проводить более точный и быстрый анализ микробиома при более низкой стоимости, обеспечивая результаты, сопоставимые с эталонными методами рРНК 16S.

Этот протокол обеспечивает регулярный высокопроизводительный мониторинг микроорганизмов в молочных продуктах, повышая скорость и точность обнаружения, в конечном итоге укрепляя системы качества и безопасности пищевых продуктов. Расширение баз данных MALDI и автоматизация рабочих процессов в промышленных лабораториях повысят идентификацию микробов, повысят пропускную способность, сократят ошибки и ускорят мониторинг микробиоты.