Подготовка образцов для метаболомных исследований методом масс-спектрометрии одиночных клеток: комбинированная промывка, закалка, сушка и хранение клеток

Нами разработаны протоколы сохранения целостности клеточных метаболитов для масс-спектрометрических исследований одиночных клеток. Мы исследовали, как условия промывки, закалки и хранения влияют на метаболиты клеток. Недавно были разработаны новые методы пробоподготовки и масс-спектрометрии для продвижения исследований метаболомики одиночных клеток, чтобы лучше понять клеточную гетерогенность и механизмы заболевания.

Исследователям необходимо преодолеть множество ключевых проблем, включая ограниченное количество образцов, сниженную чувствительность обнаружения из-за сложности образца и измененные метаболиты из-за подготовки и анализа образцов. Мы демонстрируем комплексные методы пробоподготовки, которые могут сохранить клеточные метаболиты и целостность клеток для масс-спектрометрических метаболомных исследований отдельных клеток. Наши протоколы могут предложить простой и эффективный способ подготовки, хранения и транспортировки образцов для метаболомных исследований одиночных клеток с использованием различных масс-спектрометрических методов.

Для начала инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе, содержащем 5% углекислого газа. Ежедневно контролируйте слияние клеток и пропускайте их, когда культуры достигнут 80% конфлюенции. Для пассования отсадите среду из посуды и ополосните один раз пятью миллилитрами PBS.

Инкубируйте клетки с двумя миллилитрами 0,25% трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут, чтобы облегчить отслоение клеток. Нейтрализуйте трипсин, добавив восемь миллилитров предварительно подогретой полной среды и аккуратно пипеткой, чтобы разогнать клетки. Перелейте один миллилитр суспензии в девять миллилитров свежей, готовой среды для подсчета клеток.

Чтобы засеять клетки, разведите их до конечной концентрации один умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр. Поместите индивидуальные 18-миллиметровые стеклянные крышки стекла в лунки 12-луночной пластины. Добавьте два миллилитра полной среды и 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, чтобы получилось два раза по 10 в степени пяти клеток на лунку.

Инкубируйте клетки на ночь, чтобы обеспечить прикрепление. Для промывки ячеек добавьте по два миллилитра холодного раствора формиата аммония в каждую лунку 12-луночной пластины. Затем с помощью стерильных щипцов аккуратно поднимите каждую покровную пластинку, содержащую клеточные клетки, из ее лунки и ненадолго поместите ее на две-три секунды в отдельную лунку, предварительно заполненную двумя миллилитрами холодного 0,9%-ного раствора формиата аммония.

Поместите каждую промытую крышку с формиатом аммония ячейками вверх в чашку Петри внутри контейнера из алюминиевой фольги. Медленно налейте от 10 до 20 миллилитров жидкого азота на покровные стекла, чтобы обеспечить полное покрытие. И сразу же наклоните чашку Петри с помощью пинцета, чтобы сцедить оставшийся жидкий азот.

Используя криогенные перчатки и изолированный пинцет, поместите чашку Петри, содержащую охлаждающую крышку с жидким азотом, в камеру вакуумного концентратора. Обрабатывайте образцы стандартными настройками вакуума в течение пяти-семи минут, пока видимый жидкий азот не испарится, а покровные стекла не станут сухими. Следите за тем, чтобы высушенные покровные стекла не содержали остатков жидкого азота или кристаллов льда.

Далее оберните контейнер бумажным полотенцем и перенесите в морозильную камеру при температуре 80 градусов Цельсия на 48 часов. После хранения переложите крышки с чашкой Петри в десквилизатор комнатной температуры на 10 минут. Убедитесь, что конденсированный иней или вода на защитных стеклах полностью исчезли, прежде чем удалять их из эксикатора.

Разделите образцы на две группы и обращайтесь с ними соответствующим образом. Теперь установите одиночный зонд на столик XYZ и прикрепите его к моторизованному манипулятору XYZ, расположенному под цифровым микроскопом. Подключите один зонд к масс-спектрометру для анализа SCMS.

В качестве растворителя экстракции используйте ацетоннитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты чистотой не менее 99,9%, и подавайте его со скоростью потока 150 нанолитров в минуту с помощью шприцевого насоса. Задайте параметры масс-спектрометрии для режимов положительных и отрицательных ионов. Теперь поместите два покровных стекла из первой и второй групп вместе на моторизованный столик XYZ однозондовой установки SCMS и используйте микроскоп для случайного выбора клеток для анализа.

После получения масс-спектров проанализируйте примерно 30 ячеек в группе с использованием одного и того же зонда, скорость потока растворителя и напряжение ионизации. Предварительная обработка исходных данных SCMS с помощью пользовательского скрипта R и применение удаления фона и шума с последующей нормализацией интенсивности ионов до общего ионного тока. Деизотопизируйте данные SCMS с помощью пакета Python MSD isotope.

Выполнение выравнивания пиков с помощью собственного скрипта Python. Примените ширину ячейки, равную 0,01 коэффициенту основного заряда для группирования и допуск по массе, равному 0,01 коэффициенту основного заряда или пять частей на миллион для выравнивания пиков. Проводите статистический анализ данных с помощью Metabo Analyst 6.0.

Выполните Т-критерий и сгенерируйте тепловую карту, показывающую относительные уровни метаболитов. Выберите вариант «Топ-100» и «Т-критерий» или «Inova», чтобы создать топ-100 метаболитов, ранжированных по значимости, и построить тепловую карту с использованием этих топ-100 метаболитов со значительными различиями. Наконец, выполните поиск точных значений основного заряда в базе данных метаболома человека, используя допуск по массе 10 частей на миллион для поиска в базе данных.

Анализ принципиальных компонент в режиме положительных ионов показал, что первая и вторая группы тесно перекрываются, что указывает на очень сходные профили метаболитов. В режиме отрицательных ионов наблюдалась аналогичная картина, хотя вторая группа казалась несколько более отчетливой. Анализ тепловой карты 100 основных метаболитов показал весьма согласованные закономерности распространенности между первой и второй группами в обоих ионных режимах.

Каких-либо существенных сдвигов или групповой кластеризации не наблюдается. Хотя незначительные вариации в нескольких кластерах метаболитов могут отражать различия в эффективности ионизации или стабильности метаболитов.