Прецизионная индукция и различие рефлексов кашля и чихания у мышей
3 октября 2025 г.
В этом исследовании были установлены модели кашля и чихания у мышей путем применения специфических стимулов к трахее и носовой полости, а также разработан основанный на звуке метод для различения мышиного кашля и чихания путем анализа различий в их акустических сигналах.
Этот протокол направлен на респираторные рефлексы у мышей. Мы стремимся стимулировать трахею и носовую полость для вызова кашля и чихания, а также различать эти два типа событий по аудиопризнакам. В предыдущих исследованиях часто использовался небулайзерный капсаицин или лимонная кислота для стимуляции дыхательной проверки, а также кашля и чихания у мышей.
Однако остаётся неясным, вызывает ли стимуляция дыхательной проверки с помощью небуларизации кашель, чихание или и то, и другое, поскольку в настоящее время нет надёжного способа различать эти два ответа. Для этого проекта мы разработали метод вызова кашля и чихания путём избирательной стимуляции трахеи или носовой полости. Мы также использовали акустический анализ для выявления отличительных черт между кашлем и чиханием.
Наши исследования в целом предоставляют мощный инструмент, который напрямую поддержит разработку будущих лекарств для лечения кашля и чихания. Для начала вырежьте иглу 28 калибра в канюлю длиной примерно пять миллиметров. С помощью щипцев и абразивной бумаги сгладьте оба конца и прикрепите один конец к силиконовой трубке.
Подключите канюлю, подключённую к трубке, к шприцу объемом один миллилитр и промите канюлю водой, чтобы проверить проходимость. Далее согните канюлю под углом 90 градусов с соотношением рук два к трёх. Вставьте длинный рычаг в силиконовую трубку длиной пять сантиметров.
Случайным образом распределите мышей по трём группам, каждая по шесть мышей. Теперь закрепите обезболезненную мышь в положении на спине на столе. После бритья волос в области черепа и шейки продезинфицируйте область йодофором и спиртом.
Под микроскопом разрезьте шейную кожу примерно на один сантиметр и тупо рассечьте ткани и мышцы, чтобы обнажить трахею. Проколите мягкие ткани между криковидным и трахеальным хрящами с помощью иглы калибра 32. Затем создайте минимальное отверстие трахеи с помощью офтальмологических ножниц.
Введите металлическую канюлю, покрытую силиконовой оболочкой, примерно на один миллиметр в просвет трахеи и закрепите соединение канюли с трахеей швом 7-0. Теперь разрезайте кожу головы примерно на один сантиметр и тупо проведите туннель подкожно от шеи до черепа. Проведите силиконовую трубку через подкожный туннель к черепу, закрепите её на черепе с помощью зубного цемента, а затем зашивайте кожу.
Зашвите шейный разрез и дайте животному восстановиться в течение пяти дней. Установите на ультразвуковой зонд герметичное кольцо, совместимое с портом, и вставьте зонд в порт камеры плетизмографии всего тела, чтобы обеспечить герметичный контакт. Подключите камеру плетизмографии всего тела к датчику потока и системе смещения потока.
Прикрепите силиконовую трубку, закреплённую на черепе, к удлинителю длиной 30 сантиметров и поместите мышь в камеру для плетизмографии всего тела. Протяните трубку через верхний отверстие камеры и запечатайте порт моделирующей глиной вокруг трубки. Проверьте герметичность воздуха, убедившись, что пики респираторной волны находятся в пределах четырёх плюс-минус двух.
Подключите шприц объёмом один миллилитр с пятью миллилитрами раствора капсаицина к трубке и установите его на микроинъекционный насос. Поставьте высокоскоростную камеру, обращённую к камере. Отрегулируйте расстояние и фокус камеры для чёткого обзора, а частоту дискретизации установите на 160 кадров в секунду.
Теперь одновременно запускайте программное обеспечение для плетизмографии всего тела, ультразвука и камеры. Запустите насос для инфузии капсаицина и зафиксируйте количество кашля в течение 10 минут. Подготовьте животных и все необходимые материалы для процедуры.
После анестезии и подготовки мыши закрепите её в стереотаксичной рамке. Дезинфицируйте операционную область йодофором и спиртом. Разрезайте кожу над черепом и носовой костью, обнажая носовую кость скальпелем.
С помощью микробура создайте отверстие диаметром 0,5 миллиметра в месте соединения носовой кости и латерального отростка носового перегородного хряща. Теперь обнажите носовую слизистые через отверстие для заусенцев. Аккуратно поднимите слизистую слизистую нос с помощью иглы 32-го калибра, чтобы обнажить носовую полость.
Затем закрепите полиэтиленовую трубку в стереотаксическом рычаге. Выровняйте кончик трубки заподлицо с отверстием для заусенцев, закрепите трубку на носовой кости с помощью зубного цемента, после чего зашивайте кожу. Положите мышь на грелку и дайте ей восстановиться до возвращения сознания.
Подключите камеру плетизмографии всего тела к датчику потока и системе смещения в соответствии с инструкцией производителя. Далее установите на ультразвуковой зонд прокладку, адаптированную с портом. Вставьте зонд в камеру плетизмографии и проверьте герметичность.
Переместите мышь в камеру плетизмографии и протяните полиэтиленовую трубку через верхний порт. Герметизируйте порт моделирующей глиной, чтобы закрепить трубку. Проверьте герметичность камеры и настройте камеру, как показано ранее.
Наконец, продвиньте нейлоновую филамент диаметром 0,25 миллиметра через мягкую трубку в носовую полость на глубину от нуля до трёх миллиметров. Держите пять сантиметров филамента открытым за ручной трубкой. Во время каждой стимуляции нажимайте на свободный конец филамента, пока он не согнётся примерно до 45 градусов, доставляя около 0,6 грамма силы на слизистую носа на одну секунду.
Повторяйте стимуляцию каждые 30 секунд, записывая реакции чихания в течение 10 минут. Мыши, подвергшиеся операции на трахее или носу с механической стимуляцией носа и вызовом капсаицина, значительно увеличили количество чихания и кашля соответственно. Записи плетизмографии всего тела показали как одиночные, так и двойные респираторные следы кашля, вызванного капсаицином, и механически вызванного чихания.
Звуковые осциллографии показали, что кашель-аудио имел внезапную пиковую интенсивность в начале и концентрировался в диапазоне от нуля до 30 килогерц. В то время как звук чиха постепенно увеличивал интенсивность, охватывал диапазон от нуля до 80 килогерц и имел более длительную продолжительность. Фаза компрессии при однопиковом кашле в среднем составляла около 32,39 миллисекунды, что значительно короче, чем кашель с двойным пиком, и составляет около 53,17 миллисекунд.
Средняя фаза сжатия при чихании с одним пиком составляла около 44,03 миллисекунды, тогда как чихание с двойным пиком в среднем составляла около 74,24 миллисекунды и были значительно длиннее. Одиночные пиковые паттерны наблюдались у 77,55% случаев кашля, тогда как только у 32,42% чихания были одиночные пики, при этом двойные пиковые паттерны доминировали на уровне 67,58%. Длительность звука чихания была значительно длиннее, чем кашель, хотя и с перекрывающимися диапазонами. Пересечение сенсорных афферентов носа значительно снизило вызванное капсаицином чихание, в то время как кашель остался неизменным.
Обзор
В данном исследовании были созданы модели кашля и чихания у мышей путем воздействия специфических стимулов на трахею и носовую полость. Был разработан метод на основе аудиоанализа для дифференциации кашля и чихания мышей путем анализа различий в их акустических сигналах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Респираторная физиология
- Модели на животных
Теоретические основы
- В предыдущих исследованиях для стимуляции респираторных реакций использовали небулизированный капсаицин или лимонную кислоту.
- Дифференциация кашля и чихания была затруднена из-за отсутствия надежных методов.
- Понимание этих рефлексов может помочь в разработке методов лечения соответствующих заболеваний.
- Акустический анализ позволяет получить представление о характеристиках кашля и чихания.
Цель исследования
- Индуцировать кашель и чихание у мышей посредством селективной стимуляции.
- Дифференцировать реакции кашля и чихания с помощью анализа аудиохарактеристик.
- Предоставить инструмент для будущей разработки лекарственных средств для терапии респираторных заболеваний.
Используемые методы
- Индукция кашля и чихания путем стимуляции трахеи и носовой полости.
- Использование плетизмографии всего тела для мониторинга дыхания.
- Акустический анализ для выявления характерных аудиопризнаков кашля и чихания.
- Экспериментальная установка, включающая хирургические процедуры и аудиозапись.
Основные результаты
- После стимуляции было зафиксировано значительное увеличение частоты кашля и чихания.
- Для кашля и чихания были выявлены характерные акустические признаки.
- При проведении плетизмографии всего тела были обнаружены респираторные кривые как с одним, так и с двумя пиками.
- Аудиоанализ выявил различия в интенсивности и частотных диапазонах между кашлем и чиханием.
Выводы
- Разработанные модели эффективно позволяют дифференцировать кашель и чихание у мышей.
- Данное исследование закладывает основу для будущих работ по изучению респираторных расстройств.
- Акустический анализ может стать ценным инструментом в исследованиях респираторной системы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Разграничение рефлексов кашля и чихания с анатомической и акустической точностью позволяет устранить критический пробел в валидации респираторных мишеней и механистическом снижении рисков при разработке препаратов для терапии дыхательных путей. Данная модель обеспечивает достоверное разделение перекрывающихся респираторных фенотипов, что способствует разработке прогностических биомаркеров и надежной доклинической оценке. Такой подход оптимизирует принятие решений по портфелю препаратов, предоставляя количественные и воспроизводимые конечные точки для модуляции респираторных рефлексов.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность точного изучения путей защиты дыхательных путей путем изоляции кашлевого и чихательного рефлексов.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней посредством анатомически специфической стимуляции и количественных показателей.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения перекрывающихся респираторных фенотипов.
- Повышает прогностическую уверенность при отборе кандидатов в процессе разработки препаратов для лечения респираторных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные, воспроизводимые модели для количественной оценки кашля и чихания in vivo.
- Стандартизирует акустические и плетизмографические конечные точки для последующих рабочих процессов скрининга.
- Обеспечивает масштабируемую высокопроизводительную оценку перспективных соединений, воздействующих на рефлексы дыхательных путей.
- Предоставляет количественные результаты, пригодные для сравнения между исследованиями и различными группами специалистов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с релевантными для заболевания рефлексами дыхательных путей для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации путем картирования отчетливых физиологических признаков.
- Поддерживает принятие обоснованных решений о продвижении проекта с учетом рисков на основе надежных количественных конечных точек.
- Снижает трансляционную неопределенность, предоставляя фенотипические данные, имеющие механистическое обоснование.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод объединяет этапы от первичного поиска до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации, предоставляя многократную платформу для изучения респираторных рефлексов.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути механизмов защиты дыхательных путей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные акустические и респираторные показатели для подготовки анализа.
- Аналитика: предоставляет измерения с высоким разрешением и статистическое разграничение между актами кашля и чихания.
- Трансляционные исследования: связывают доклинические и трансляционные исследования путем сопоставления результатов модели с клиническими конечными точками респираторных заболеваний.
- Корпоративное использование: создает стандартизированную масштабируемую базу для проведения текущих респираторных исследований и оценки соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации респираторных мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов респираторных рефлексов.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и капиталоэффективному управлению портфелем.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвижение кандидатов в респираторную терапию.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на мышах и знание физиологии дыхания.
- Необходим доступ к оборудованию для плетизмографии всего тела, высокоскоростной видеосъемке и ультразвуковой аудиозаписи.
- Требуется строгая стандартизация протоколов стимуляции и записи между всеми исследовательскими группами.
- Адаптация метода для других видов животных или моделей заболеваний может потребовать оптимизации протокола.
- Потенциальные ограничения включают сложность хирургического вмешательства и необходимость использования специализированных аналитических инструментов.
