Визуализация привратника: оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера у взрослых рыбок данио-рерио на основе синего красителя

Это исследование направлено на разработку надежного, простого и экономически эффективного метода оценки целостности гематоэнцефалического барьера у взрослых рыбок данио. Большинство исследований на рыбках данио не имеют простого и надежного способа измерения нарушения гематоэнцефалического барьера, а существующие методы часто являются сложными или дорогостоящими. Таким образом, этот протокол предлагает практичное и доступное решение.

Этот протокол прост, экономичен и сочетает в себе как визуальный, так и измеримый анализ, и все это без необходимости использования дорогостоящего оборудования или сложных этапов. Предоставляя простой, воспроизводимый протокол, лабораториям будет проще изучать нейроваскулярные изменения на моделях болезней взрослых рыбок данио. Для начала обезболите рыбок данио, постепенно снижая температуру воды с 12 градусов по Цельсию до семи градусов по Цельсию до тех пор, пока рыба не перестанет реагировать на тактильные раздражители.

С помощью инсулинового шприца 31-го калибра введите 20 микролитров 1% синего Эванса, или красителя EB, во внутрибрюшинную полость рыбы и слегка надавите на место инъекции в течение 10 секунд, чтобы предотвратить обратный поток. Теперь переложите рыб в резервуар для восстановления и дайте восстановиться в течение 30 минут. Следите за травмами, смертностью или изменениями в поведении рыб в течение этого времени.

Для установления положительного контроля подготовьте стерильную иглу 31-го калибра, прикрепленную к инсулиновому шприцу, для выполнения процедуры ножевого ранения. После 30-минутного восстановительного периода снова обезболите рыб, как было продемонстрировано ранее. Расположите рыбу вертикально на плоской холодной поверхности, например на пакете со льдом.

Введите иглу в одну сторону цефалона под углом 90 градусов на глубину, не превышающую 1,5 миллиметра. Затем переложите рыбу в резервуар для восстановления и дайте ей восстановиться в течение 30 минут. После усыпления рыбы путем переохлаждения с помощью стерильного лезвия или хирургических ножниц обезглавьте усыпленную рыбу.

Дважды промойте голову в соотношении 1X PBS, используя соотношение рыбы и PBS 1:20, чтобы удалить лишнюю кровь и синий краситель Эванса. Затем зафиксируйте голову в 4% параформальдегиде, используя соотношение рыбы и фиксатора 1:20, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Поместите неподвижную голову в чистую чашку Петри и препарируйте мозг с помощью пинцета с заостренным концом.

Непрерывно добавляйте PBS по каплям во время рассечения, чтобы сохранить ткань увлажненной и предотвратить высыхание. Дважды промойте препарированный мозг в двух отдельных ваннах PBS и поместите ткань на пластину с 1%-ным агарозом, чтобы сохранить влагу и предотвратить усадку. Наблюдайте за рассеченными тканями мозга под стереомикроскопом.

Чтобы начать количественный анализ, загрузите и установите программное обеспечение Fiji и откройте файл изображения мозга на Фиджи. Выполните деконволюцию цвета, выбрав «Изображение», затем «Цвет», «Деконволюция цвета» и выберите RGB. В результате мы получим три отдельных изображения, представляющих красные, зеленые и синие оттенки.

Теперь активируйте изображение синего канала, обычно обозначенное как Color 3, щелкнув по изображению. Преобразуйте его в 8-битные оттенки серого, выбрав «Изображение», затем «Тип» и «8-бит». Далее, чтобы измерить интенсивность серого на 8-битном изображении, задайте параметры измерения, выбрав Analyze и Set Measurements.

Затем выберите площадь и среднее значение серого. С помощью инструмента выделения прямоугольника нарисуйте область интереса одинакового размера и измерьте интенсивность серого, выбрав «Анализ», а затем «Измерить». Нормальные рыбки данио демонстрировали типичный коричневатый оттенок кожи, а рыбки данио, введенные EB, демонстрировали заметный голубоватый оттенок.

Для исследования целостности гематоэнцефалического барьера в модели паркинсонизма у взрослых рыбок данио-рерио сравнивали экстравазацию красителя EB в ткани мозга между контролем, вводимым физиологическим раствором, и паркинсоническими рыбками данио. В отрицательной контрольной группе кровеносные сосуды в головном мозге выглядели красноватыми, что указывает на отсутствие экстравазации EB-красителя. Напротив, контрольная группа, получавшая физиологический раствор, позитивный контроль и группа паркинсонизма показали голубоватую окраску сосудистой сети головного мозга, что подтверждает успешную системную циркуляцию красителя EB.

Рассеченный мозг из отрицательной контрольной группы оказался белесым с отчетливо видимыми кровеносными сосудами, подтверждающими отсутствие окрашивания БЭ. В группе положительного контроля интенсивная синяя окраска вокруг мозговой ткани указывала на утечку красителя из-за преднамеренного нарушения гематоэнцефалического барьера. В группе, получавшей физиологический раствор, окрашивание БЭ оставалось ограниченным кровеносными сосудами, что указывает на неповрежденный гематоэнцефалический барьер.

Группа паркинсонистов показала более темный, более диффузный рисунок окрашивания синим цветом, указывающий на значительную утечку красителя EB и нарушение гематоэнцефалического барьера. Количественный анализ оттенков серого показал значительно более низкие значения интенсивности серого в группе с болезнью Паркинсона по сравнению с группой, получавшей инъекции физиологического раствора.