Точный фаговый мутагенез с помощью систем CRISPR-Cas с помощью NgTET

Мы изучаем фаговую инфекцию на молекулярном уровне. Это действительно фундаментальная наука. Тем не менее, мы занимаемся не только фундаментальной наукой, но и стремимся перевести эту фундаментальную науку в приложения, где мы используем эти знания для изучения фаговой инфекции, а также для использования в фаговой инженерии и для терапевтических целей.

Одним из самых последних достижений в области исследований фагов является открытие бактериальной иммунной системы. Эта иммунная система присутствует у всех бактерий, и они определили или создали инструменты для реальной борьбы с фагом. Тем не менее, фаг довольно умен.

Фаг также смог идентифицировать инструменты и разработать инструменты, которые позволяют ему избежать этих иммунных систем. И одним из инструментов на самом деле является модификация его ДНК за модификацией. И это особенно интересно для нас, потому что изучение химической природы этих модификаций ДНК, которые фаги генерируют для ухода от иммунной системы, действительно интересно, а также позволяет нам стать инструментом для создания фага в конечном итоге.

За последние 10 лет замечательные технологии были разработаны замечательными коллегами по всему миру. Одной из таких технологий является, например, секвенирование нового поколения. Основываясь на этой технологии, мы можем секвенировать фаги, а также целые геномы хозяина на молекулярном уровне.

С другой стороны, развивалась масс-спектрометрия, что-то вроде протеомики. CRISPR – это замечательный инструмент, который сейчас применяется в различных сферах жизни. И мы также используем это сейчас для создания фагового генома.

Это лишь несколько замечательных технологий, которые изменили наше представление о фагах сегодня. Когда мы говорим о текущих проблемах, одной из проблем, с которыми мы сталкиваемся, является инженерная био-CRISPR фагового генома. Геном фага полностью модифицируется с помощью модификаций ДНК, и ядерные ACEs CRISPR на самом деле не способны расщеплять ДНК.

Так что это действительно проблема, которую нам нужно решить, если мы хотим спроектировать геномы бактериальных фагов. Моя группа открыла совершенно новый строительный блок РНК. Мы обнаружили, что специфические транскрипты переносят на своем пяти основных концах, так называемом окислительно-восстановительном спектре, никотинамидадениндинуклеотиде короткий NAD, и мы также недавно впервые обнаружили это во взаимодействиях фагов E-coli T4.

Основываясь на этом открытии, мы также определили, что РНК и белки могут взаимодействовать друг с другом совершенно новым образом. Мы обнаружили, что NAD, который я описал ранее, работает как молекулярный клей, связывая РНК и белки друг с другом. Этот восторг РНК является совершенно новым способом того, как РНК и белки взаимодействуют друг с другом в природе.

И мы сделали это открытие в эко-антифаговом взаимодействии. Мы также сейчас заинтересованы в том, чтобы перевести эту фундаментальную науку в приложения, например, в область терапии на основе РНК. Для начала обработайте 500 микролитров фаговой суспензии 20 единицами ДНК 1.

Добавьте в пробирку два микролитра перемешанных РНК АТ1. Выдержите обработанную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Далее загрузите 500 микролитров обработанного фагового раствора поверх подготовленного градиента сахарозы.

Центрифугируйте градиент при 70 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Зажгите центрифужную трубку снизу, чтобы визуализировать мутную фаговую полосу в градиенте. Затем с помощью тупой канюли осторожно извлеките фагсодержащую фракцию в новую ультраультрацентрифужную пробирку.

Теперь добавьте 30 миллилитров ледяного буфера ТМ в пробирку и центрифугу. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера ТМ после сброса надосадочной жидкости. Храните ресуспендированные фаги в стеклянном флаконе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

Добавьте один микрограмм протеиназы К к ресуспендированным фагам. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте к пробе равный объем фенолхлороформа, смесь изоамилового спирта.

Переверните для хорошего перемешивания и центрифугируйте. Перенесите водную фазу в новую реакционную трубку и повторите экстракцию три раза. Проведите три экстракции хлороформа обратно с использованием равного объема хлороформа для удаления остаточного фенола.

Затем осадите ДНК, добавив 0,1 объема трех моляров ацетата натрия при PH 5,5 и 2,5 объема этанола. Выдерживайте смесь в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию. На следующий день центрифугируйте образец при 15 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать ДНК.

Дважды промойте гранулу ДНК 200 микролитрами 70% этанола. Осторожно встряхните пробирку и снова центрифугируйте. Осторожно удалите надосадочную жидкость.

Затем восстановите очищенную ДНК в суспензии в сверхчистой воде. Храните ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Инокулируйте клетки Escherichia coli BL 21D 3, которые трансформируются как плазмидой PET 28 NGTet, так и экспрессирующей плазмидой CAS 12 или CAS 9.

Выращивают культуру в среде ЛБ с добавлением соответствующих антибиотиков при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. Индуцируйте экспрессию NG TED путем добавления 0,05 миллимоляра IPTG и инкубируйте еще два часа при температуре 37 градусов Цельсия. В качестве контроля сравните штаммы E.coli BL 21 D3 с гиперэкспрессией NgTET и без нее.

Перенесите 300 микролитров культур E.coli в стерильную пробирку. Инфицируйте культуру либо диким типом T4, либо фагом, обработанным NgTET, при кратности инфекции 0,01. Осторожно перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение фагов, затем снова инкубируйте.

Добавьте смесь фагов бактерий к четырем миллилитрам мягкого шнека LB, содержащего 0,75% шнека и антибиотики. Перемешайте тщательно, но аккуратно, чтобы избежать образования пузырьков. Вылейте мягкую шнековую смесь на предварительно прогретую пластину шнека LB.

Дайте пластине ненадолго застыть при комнатной температуре и выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день подсчитайте бляшки, чтобы определить количество единиц, образующих бляшки. Для выбора счетчика заражайте E.coli наложите спейсер на 13 А, используя выбранные контраги.

Выполните контротбор в тех же условиях, что и для мутагенеза. После инкубации отфильтруйте натант SUP через фильтр 0,45 микрометра для удаления бактериального мусора. Используйте выбранные счетчиком и отфильтрованные фаги для анализа бляшек на штамме E.coli B, чтобы изолировать отдельные бляшки для последующей валидации.

Фаговая полоса была хорошо видна, когда образец фага Т4 был достаточно концентрирован. Экспрессия белка NgTET в E.coli была подтверждена фагом SDS, показывающим его присутствие как в растворимых, так и в нерастворимых фракциях после лизиса клеток и центрифугирования. Хроматограммы показали, что относительное содержание диоксиаденозина, дийодгидроксихинолина и тимидина не изменилось между ДНК фага дикого типа и ДНК фага Т4, обработанной NgTET.

Содержание модифицированных производных цитозина было значительно снижено в ДНК фага, обработанного NgTET, по сравнению с необработанным образцом. Плазмида, содержащая ген NgTET и области гомологии для целевого мутагенеза, была сконструирована с помощью клонирования золотых ворот. ПЦР-скрининг подтвердил успешную амплификацию целевого гена кобылы в полосах со второго по девятый из геля Agros, что указывает на положительные попадания среди выбранных бляшек.

В ДНК фага дикого типа Т4 относительная распространенность 5 гликозилгидроксиэтил 2 прайм-деоксидина была высокой. В ДНК фага Т4, обработанной NgTET, уровни 5 гликозилгидроксиэтил-2 прайм-деоксидина были сильно снижены по сравнению с диким типом. ДНК фага Т4, обработанная каталитическим неактивным мутантом NgTET D234 A, сохранила высокие уровни 5-гликолксиэтил2-прайм-деоксидина.

Восстановленное потомство фагов Т-4 показало почти восстановленные уровни 5-гидроксиметил-2-прайм-деоксидина по сравнению с диким типом.