Оценка ответов листьев на микробные вторичные метаболиты с использованием высокопроизводительного формата

Моя лаборатория занимается взаимодействием растительных микробов с конечной целью повышения устойчивости тюленевых культур с помощью генетики. Недавние достижения показали, что вторичные метаболиты микроорганизмов играют ключевую роль в повышении восприимчивости или устойчивости растений. Для начала используйте пробковый отверстие диаметром четыре миллиметра, чтобы собрать три листовых диска на растение, избегая средней жилы.

Острым концом приложите скручивающее движение, чтобы предотвратить мацерацию ткани. Добавьте вторичные метаболиты или растворители в желаемой концентрации в отдельные колодцы пластины с 96 лунками, чтобы получить итоговый объём в 200 микролитров. Аккуратно положите диски листьев в колодцы.

Поместите 96-колодную пластину с открытой крышкой в колокольчик с вакуумным соплом. Затем подключите вакуумный шланг к соплу колокольной банки и включите вакуумное давление на 9,8 фунта на квадратный дюйм на 10 секунд. Отключите вакуум и медленно спустите давление в течение 10 секунд, затем повторите цикл вакуума.

Теперь поставьте крышку обратно на пластину с 96 лунками и инкубуйте её на орбитальном шейкере под источником света. Расположиться в 23 сантиметрах над шейкером в течение четырёх часов. Промыйте зонд в ультрачистой воде и слегка промокните безворсовой салфеткой для сушки.

Обратите внимание на показатели проводимости воды для будущего использования. В течение четырёх-шести часов после обработки измеряйте и фиксируйте проводимость в отдельных скважинах, погружая зонд в жидкость вокруг диска листа. Держите пластину под углом 45 градусов, чтобы убедиться, что зонд полностью погружен.

После промывания зонда демонстрируется раньше, иногда проверяйте проводимость воды для подтверждения устойчивости зонда. Затем наместите пластиковую потолочную плёнку поверх 96-ямеченной пластины и верните её в орбитальный шейкер для ночной инкубации. Для приготовления пероксидазного субстрата нагрейте 40 миллилитров дистиллированной стерильной воды до 70 градусов Цельсия в стакане с баром для перемешивания.

Растворите 50 миллиграммов пяти аминосалициловых кислот в нагретой воде. Затем добавьте дополнительную воду, чтобы увеличить общий объём до 50 миллилитров, и отрегулируйте pH до шести с помощью гидроксида натрия. Защитите светочувствительный раствор, покрыв контейнер алюминиевой фольгой.

В янтарной конической трубке объёмом 50 миллилитров приготовьте раствор перекиси водорода 1% в сверхчистой воде. Затем добавьте 10 микролитров раствора перекиси водорода 1% на миллилитр пяти растворов аминосалициловой кислоты, необходимых для получения пробиральной среды. В нужное время перемешайте пять раз, а затем перенесите 50 микролитров из каждой ямы пластины образца на новую пластину.

Добавьте 50 микролитров пробирной среды и инкубуйте при комнатной температуре три минуты. Чтобы остановить реакцию, добавьте 20 микролитров двух нормальных гидроксида натрия в каждую скважину и используйте считыватель пластин для измерения поглощения каждой ямы на 595 нанометров. Вода и 0,1% диметилсульфоксид вызывали схожие утечки ионов и уровень активности пероксидаз, что подтверждает их использование как отрицательные контрольные.

Обработка одним микромоляром FLG 22 значительно вызвала утечку ионов, активность пероксидазы и выработку каллозы, что подтвердило наличие надёжного положительного контроля. Обработка Грамиллином вызывала значительную утечку ионов и выработку каллозы, но имело разное влияние на активность пероксидазы. Сурфактин на 10 микромолярах индуцировал как активность пероксидаз, так и производство каллозы, при этом утечка ионов оставалась неизменной.

Обработка токсином Т-2 подавляла активность пероксидазы, одновременно стимулируя выработку каллозы и не влияя на утечку ионов. Наш гидроанализ позволяет исследователям отбирать три различных стрессовых ответа в одном образце, что позволяет максимально использовать ограниченное количество вторичных метаболитов микробов. Возможность сравнивать 96 образцов в одной пластине позволяет исследователям проводить анализы на уровне популяционной генетики или системную биологию для понимания взаимодействий растительных микробов.

Мои исследования по-прежнему будут сосредоточены на взаимодействии растений с микробами и характеристике генов растений, которые мы можем использовать для развития устойчивости к болезням у зерновых культур.