Измерение одноклеточного старения с помощью биомаркера хроматина и эпигенетического старения на основе визуализации

Мы разработали хроматиновый и эпигенетический возрастной образ на основе визуализации — новую технику, предназначенную для количественного измерения старения и омоложения при разрешении одной клетки. Часы метилирования ДНК оценивают биологический возраст, но зависят от линейной регрессии, требуют больших когорт и уничтожают образцы, что делает их дорогими и непригодными для крупномасштабных или продольных исследований. Для начала переложите замороженные органы и ткани в заранее охлаждённую ступку, накрываемую сухим льдом.

Вылейте жидкий азот на замороженную ткань и тщательно измельчите её с помощью предварительно охлаждённого пестика, пока не получится равномерно мелкий порошок. Используя предварительно охлаждённую металлическую лопатку, измельчённую тканью аликвот в несколько трубок. После извлечения ядер смешайте их с трипан-блю в равном пропорции в отдельной трубке.

Перенесите 10 микролитров смеси на гемоцитометр или загрузите её в автоматический ячейный счётчик. Введите и проверяйте все метаданные, включая идентификаторы образцов, состояния и биомаркеры в карте пластин, а также экспортируйте CSV-файл. Теперь раздайте 10 000 ядер на одну скважину в объёме от 20 до 30 микролитров в пластину на 384 лунки.

Центрифугуйте пластину при температуре 1000 г, при ускорении девятом и замедлении на четыре, на 10 минут при 4 градусах Цельсия. Далее фиксируйте ядра с равным объёмом 8% параформальдегида и PBS, и инкубируете 10 минут при комнатной температуре. После удаления фиксатива добавьте 30 микролитров 0,1 молярного глицина в PBS и инкубуйте пять минут при комнатной температуре.

Удалите раствор глицина и дважды промыйте колодцы 100 микролитрами PBS. Удалите PBS из каждой скважины и добавьте 30 микролитров блокирующего раствора, содержащего 2% BSA и 0,5% тритон X-100 в PBS. Инкубировать тарелку в течение часа при комнатной температуре.

После удаления блокирующего раствора инкубировать образец 25 микролитрами раствора первичного антитела при температуре четыре градуса Цельсия. Затем промыйте колодцы три раза 100 микролитрами PBS, каждая промывка длится три минуты при комнатной температуре. Добавьте 25 микролитров вторичного раствора антител и инкубируемые в течение двух часов при 4 градусах Цельсия.

Затем промыйте колодцы три раза с помощью 100 микролитров PBS, каждая промывка длится три минуты при комнатной температуре. Окрашивайте ядра DAPI или Hoechst, добавив 30 микролитров красителя с концентрацией 0,01 миллиграмма на миллилитр, и один раз промыйте пластину 100 микролитрами PBS, чтобы удалить избыток красителя. Скачайте скрипты рабочих процессов из репозитория GitHub.

После завершения загрузки распакуйте файл и извлечьте его содержимое. Организуйте репозиторий клонированных изображений так, чтобы структура папки совпадала с форматом, который предполагает рабочий процесс для правильного выполнения скриптов. Затем откройте приложение Terminal, если оно работает на Linux или Mac OS, или приложение WSL, если используете Windows.

Измените рабочую папку в папку клонированного репозитория, введя необходимую команду в терминале и нажав Enter. Создайте новую вычислительную среду с названием Image_workflow с помощью Conda с Python версии 3.10 и нажмите Enter. Активируйте новосозданную среду Conda командой conda activate Image_workflow.

Установите Poetry, менеджер пакетов на Python, в активированной среде с помощью установщика PIP. Затем установите все необходимые пакеты на Python, необходимые для рабочего процесса, используя Poetry. Теперь настройте CUDA в среде Conda, чтобы включить функциональность графического процессора на этапе сегментации.

Откройте приложение Terminal и измените папку на клонированную. Активируйте среду Conda, введя команду ниже и нажав Enter. Откройте основной файл рабочего процесса в редакторе кода или текста, таком как VS Code или Notepad, чтобы настроить параметры анализа.

Задайте имя проекта, назначив переменную p безопасному идентификатору короткой файловой системы, используемому для организации выходных данных. Задайте список каналов для извлечения признаков в chs, включая канал сегментации, если требуются функции из этого канала. Используя ImageIndex и метку канала в качестве ключа, сопоставьте идентификатор канала изображения из имён файлов в точный заголовок столбца с чувствительностью к регистру карты пластин, сохранённый ранее.

Затем установите расположения данных, назначив orgDataLoadPath маршруту набора данных, orgDataSubfolder — подпапке изображения при необходимости, а resultsSavePath — выходному маршруту. Подтвердите расширение имени файла в imageFileFormat. Затем отредактируйте imageFileRegEx, чтобы использовать группы захвата с названиями на Python для необходимых частей, включая строку, столбцу, поле, позицию Z и канал.

Теперь настройте сегментационный канал в segmentation_ch на ядерный канал, используемый для обнаружения объектов. Решите, использовать ли коррекцию освещения, установив illumiCorrection и установив true для вычисления и применения базовых моделей. Затем установите физический размер вокселя в микрометрах в voxel_dim как ZYX, используя метаданные микроскопа.

Сохраните файл и закройте редактор после проверки каждого параметра. Наконец, запустите скрипт рабочего процесса, чтобы получить изображения и провести проверку, оставив терминал открытым во время запуска скрипта. Визуализируйте результаты и экспортируйте исходные изображения для дополнительного анализа во внешнем программном обеспечении.

Репрезентативные изображения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток показали чётко отделённые ядра, окрашенные DAPI, триметилированный гистон H3 на лизине 27 и ацетилированный гистон H3 при лизине 27. Анализ изображений печени и скелетных мышц выявил значительные различия между молодыми и старыми образцами, при этом у старых мышей OSKM изображение было снижено по сравнению со старыми, что указывает на частичное перепрограммирование. Анализ отдельных животных показал, что некоторые старые образцы OSKM имели значительно сниженные значения изображений по сравнению со старыми мышами.

Этот протокол позволяет исследователям изучать возрастные изменения хроматина и эпигенетической организации при едином клеточном разрешении между разными типами клеток и тканями. Наш метод на основе визуализации не разрушает, сохраняет структуру хроматина, позволяет проводить повторные измерения и более экономически эффективен при крупномасштабных или продольных исследованиях. Будущие исследования будут сосредоточены на добавлении большего количества эпигенетических маркеров и изучении внутриядерных структур, связанных со старением.