Выделение РНК из эпителия глазного хрусталика мыши и объемных масс волоконных клеток

Наше исследование сосредоточено на хрусталике, специализированной прозрачной ткани в передней камере глаза. Хрусталик состоит из двух типов клеток: эпителиальных клеток и волоконных клеток, которые имеют разные функции и разнообразные транскриптомы. Существуют трудности с извлечением достаточной концентрации РНК из эпителиальных клеток в монослое хрусталика, что затрудняет изучение транскриптомов в эпителиальных клетках по сравнению с волоконными клетками.

Способность четко разделять основные типы клеток хрусталика позволяет глубже исследовать уход за хрусталиком и дисрегуляцию. Это позволяет охарактеризовать специфические для типа клеток нарушения, которые приводят к возрастным патологиям хрусталика. Для начала микродифицируйте хрусталик из только что энуклеированных глаз усыпленной мыши.

Аккуратно прокатите линзу на чистой, деликатной салфетке с помощью изогнутых щипцов, чтобы удалить остатки прилипшей лишней лентикулярной ткани. С помощью тонких прямых щипцов неглубоко проткните капсулу хрусталика вблизи экватора, затем аккуратно отсоедините капсулу хрусталика от волокнистой массы, оставив эпителиальные клетки хрусталика прикрепленными к капсуле. Удалите из капсулы все крупные кусочки волокна, которые могли оторваться во время декапсуляции.

Теперь аккуратно захватите капсулу тонкими прямыми щипцами и взболтайте ее в PBS, чтобы выбить все оставшиеся волокна. Пипеткой нанесите 400 микролитров холодного реагента TRIzol в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра на образец. Поместите две капсулы для линз или две волокнистые массы в каждую соответствующую трубку.

Плотно закупорьте трубки. Аккуратно гомогенизируйте насыпные массы волокон хрусталика в трубках с помощью чистого пластикового пестика, затем инкубируйте. В вытяжной шкаф добавьте 200 микролитров хлороформа на 400 микролитров реагента ТРИзол в каждую пробирку.

Плотно закройте трубки и энергично встряхивайте рукой в течение 15 секунд, держа большой палец на дне трубки, а указательный палец на колпачке. После инкубации образцов при комнатной температуре в течение 10-15 минут для обеспечения фазового разделения, центрифугируйте образцы при 14 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. В вытяжном шкафу осторожно переложите водную фазу прозрачного верха в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и отметьте объем.

Затем добавьте этанол 200 пробы в водную фазу в объемном соотношении один к одному. Теперь аккуратно перемешайте раствор, несколько раз перевернув трубку. Перенесите смешанный раствор в спиновую колонку РНК с помощью пипеттера.

Центрифугируйте спиновые колонны при 16 000 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Затем отбросьте проточный поток и пипеткой нанесите 400 микролитров буфера для подготовки РНК в спиновую колонку. После повторного центрифугирования колонн отбросьте сквозной поток.

Добавьте 700 микролитров буфера для промывки РНК в отжимную колонку. После того, как окончательная промывка будет завершена и проточный поток будет отброшен, снова центрифугируйте при 16 000 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия, чтобы убедиться, что вращающаяся колонна сухая. Переместите высушенную спиновую колонку в новую, чистую и маркированную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров.

Затем пипеткой нанесите 15 микролитров воды, не содержащей РНКазы, прямо на мембранный фильтр и инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре. Центрифугируйте спиновую колонку в последний раз при 16 000 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия, чтобы вымыть очищенную РНК. Теперь удалите и отбросьте спиновые колонки.

Очищенная РНК будет присутствовать в жидкости, собранной в микроцентрифужных пробирках. Инкубируйте образцы РНК при температуре от 55 до 65 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы способствовать ресолюбилизации. Сразу же поместите образцы на лед после этапа нагрева.

Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия. Наблюдалась дифференциальная экспрессия генов между выделенным эпителием и объемной массой волоконных клеток. Ген Gja1, также известный как коннексин 43, экспрессировался преимущественно в эпителиальных клетках.

Напротив, ген Gja3, который кодирует коннексин 46, имел более высокую экспрессию в волоконных клетках. Gja8, или коннексин 50, экспрессировался как в эпителиальных, так и в волокнистых клетках. Экспрессия Cdh1, кодирующего E-кадгерин, была высокой в эпителиальных клетках, в то время как экспрессия Cdh2, кодирующего N-кадгерин, была обнаружена как в эпителиальных клетках, так и в волоконных клетках.

Экспрессия Pax6 была сильно обогащена в эпителиальных клетках и практически отсутствовала в волоконных клетках. Напротив, ген Crygs, кодирующий альфа-S кристаллиновый белок, продемонстрировал высокую экспрессию в волоконных клетках по сравнению с эпителиальными клетками.