Генерация индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками плоских органоидов кожи, несущих волосы, с использованием системы культивирования границы раздела воздух-жидкость
17 октября 2025 г.
В этом протоколе описан метод производства органоидов кожи, содержащих волосяные фолликулы, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с использованием плоской, физиологически значимой системы культивирования воздушно-жидкостного интерфейса для репликации архитектуры и функции кожи.
Цель моих исследований — попытаться разработать модель повреждений, вызванных УФБ, чтобы изучать патогенность редкого заболевания — пигментной ксеродермы, точнее, XPA. Одна из сложностей этих моделей in vitro заключается в том, что их культивирование занимает довольно много времени, примерно четыре месяца, и поскольку это ещё довольно молодая область, нам нужно немного лучше их охарактеризовать. Преимущества этой модели — 3D-модель, основанная на hiPSC, культура, в которой интерфейс воздух-жидкость воспроизводят архитектуру человеческой кожи и имеют кожные придатки, такие как сальные железы и волосяные фолликулы.
Для начала приготовьте одномолярный раствор, добавив гранулы гидроксида натрия в пустую трубку объёмом 15 миллилитров. Добавьте дистиллированную воду в гранулы и закрутите трубку, чтобы растворить гранулы. Стерилизуйте раствор гидроксида натрия с 0,1 молярным фильтром с помощью мембранного фильтра размером 0,2 микрометра.
На льду разбавьте раствор коллагена типа I с 10-кратным PBS, гидроксидом натрия 5 миллимоляров и дистиллированной водой для регулировки конечного объёма. Распределите по 150 микролитров этого коллагена в каждую вставку, помещая его в стандартную пластину на 12 лунок. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы коллагеновый гель полимеризировался.
Далее вырежьте наконечники размером P1000 с нагретым скальпелем, чтобы получить широкие наконечники. Затем используйте широкие наконечники отверстия, чтобы разместить выбранную кистозную структуру с небольшим запасом на крышку чашки Петри диаметром 10 сантиметров. Аккуратно удаляйте любые побочные продукты структуры стерильным скальпелем, стабилизируя их стерильными щипцами с противоположной стороны.
Вырезать примерно один миллиметр с обоих концов кистозного кожного органоида, расположенного рядом с первым разрезом, с помощью скальпеля. С помощью стерильных щипцов аккуратно разверните верхний слой кожи. Разрежьте ткань на две-четыре части в зависимости от размера.
Затем, используя стерильные щипцы, переместите каждую деталь на вставку с коллагеновым покрытием с эпидермисом вверх. Добавьте 600 микролитров OMM в каждую скважину стандартной пластины с 12 яками. Перенесите вставку обратно на пластину с 12 лунками, содержащую OMM.
Затем поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Один плотный клеточный агрегат, включающий большинство клеток, был сформирован к нулевому дню благодаря аккуратному обращению и центрифугированию. Правильная индукция поверхностной эпидермы привела к образованию тонкого прозрачного эпителия на внешнем слое агрегата к третьему дню. К 12-му дню тонкий слой мезенхимальных клеток накопился на одном полюсе кисты.
Волосяные плакоды и колышки стали видимы между 50 и 80 днями, после коиндукции эпителий и мезенхимы. Органоиды без видимых плакодов имели чрезвычайно тонкий эпителий и были исключены из планарного перехода. Для формирования плоских органоидов кожи выбирались только кисты диаметром не менее пяти миллиметров с поляризованными побочными продуктами.
Волосяные фолликулы постепенно удлинялись в течение 27 дней культуры между воздухом и жидкостью. Селаночные железы стали видны примерно на 14-й день в планарной конфигурации. Пигментация постепенно увеличивалась в органоидах со временем.
Окрашивание гематоксилином и эозином выявило стратифицированный эпителий и базальную мембрану, отделяющую его от дермы. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило архитектуру, похожую на человеческую кожу, в плоских кожных органоидах.
Обзор
В данном исследовании разработана модель повреждения, индуцированного UVB-излучением, для изучения пигментной ксеродермы, с основным акцентом на создании органоидов кожи, содержащих волосяные фолликулы, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Органоиды культивируют с использованием физиологически релевантного интерфейса «воздух-жидкость» для эффективного имитирования архитектуры и функций кожи человека.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Патогенность пигментной ксеродермы
- Разработка моделей кожи in vitro
- Использование технологии трехмерных органоидов
Теоретические сведения
- Проблемы культивирования органоидов кожи
- Современные представления о биологии кожи
- Значение волосяных фолликулов и придатков кожи в исследованиях
Используемые методы
- Культивирование на границе раздела фаз воздух-жидкость для развития органоидов
- Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в качестве источника
- Методы иммунофлуоресцентного и гистологического окрашивания
Основные результаты
- Успешное получение органоидов кожи с волосяными фолликулами
- Наблюдение ко-индукции эпидермальных и мезенхимальных клеток
- Подтверждение архитектуры, подобной человеческой коже, с помощью окрашивания
Заключение
- Данное исследование позволяет глубже понять процесс развития органоидов кожи из стволовых клеток.
- Демонстрирует потенциал использования этой модели для изучения заболеваний кожи.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Органоиды плоской волосистой кожи человека, полученные из иПСК и культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, представляют собой физиологически релевантную систему in vitro для изучения биологии кожи и формирования придатков. Данная платформа позволяет проводить прогностическое моделирование ответов тканей на воздействие факторов окружающей среды и фармакологических агентов, что способствует трансляционным исследованиям и механическому снижению рисков в дерматологических исследованиях и разработках. Этот подход повышает уверенность в портфеле разработок, обеспечивая создание надежных и воспроизводимых моделей кожи для раннего поиска и доклинической оценки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать межклеточные взаимодействия в микросреде кожи человека.
- Способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет моделирования развития придатков кожи и стратификации тканей.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для путей, связанных с кожей, и механизмов редких заболеваний.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для количественной оценки воздействия препаратов и повреждения тканей.
- Предоставляет валидированные биологические системы с волосяными фолликулами и сальными железами для анализа соединений.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для различных прикладных исследований кожи.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирует ответы тканей, имеющие значение для заболевания, включая повреждения, вызванные UVB-излучением, и инфекции, вызванные патогенами.
- Соответствует стратегиям трансляционного поиска биомаркеров посредством молекулярного и гистологического анализа.
- Обеспечивает принятие решений о продвижении с учетом рисков, связывая этап первичного поиска и доклиническую валидацию.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Эта система органоидов охватывает все этапы — от ранних открытий до доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы, уточнять сигнальные пути и проводить прогностическую аналитику в области биологии кожи.
- Открывающая биология: Поддержка исследований архитектуры кожи и формирования придатков, основанных на проверке гипотез.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных результатов для анализов ответа на воздействие лекарственных средств и повреждающих факторов.
- Аналитика: Возможность получения молекулярных и гистологических данных для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечение преемственности от моделирования in vitro до доклинических исследований заболеваний.
- Корпоративное использование: Создание многократно используемой платформы для различных инициатив по изучению кожи и скринингу.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях кожи.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы создания органоидов.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет внедрения надежного моделирования in vitro.
- Влияние на портфель: Способствует приоритезации с учетом рисков и продвижению дерматологических активов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, манипуляциями с органоидами и тканевой инженерией.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для культивирования на границе раздела фаз «воздух-жидкость» и молекулярного анализа.
- Требуется межгрупповая стандартизация контрольных точек качественной оценки и критериев отбора.
- Может потребоваться адаптация для различных моделей заболеваний или типов тканей в зависимости от целей исследования.
- Длительные сроки культивирования и необходимость постоянной характеристики полей являются практическими ограничениями, которые следует учитывать.
