Модель ампутации задних конечностей крысы ниже колена и немедленное целенаправленное мышечное реиннервирование

В данном исследовании изучается боль, связанная с повреждением нервов и ампутацией, а также то, как перенаправление нервов может повлиять на эту боль. Ампутация ограничивает возможности стандартной оценки болевых ощущений. В данном протоколе используются модифицированные и альтернативные тесты для измерения болевого поведения после ампутации.

Для начала возьмите крысу линии Sprague Dawley в возрасте от 8 до 10 недель и весом от 250 до 300 граммов. Включите греющий коврик и подготовьте стерильное операционное поле. Разложите все стерильные инструменты и материалы, необходимые для проведения операции.

После наркотизации крысы изофлураном (индукционная доза 4%, поддерживающая доза от 1 до 2%) выбрейте шерсть, начиная от нижней части спины и далее по всей длине задней конечности. Очистите место хирургического вмешательства антисептическим раствором повидон-йода, после чего протрите его спиртовой салфеткой. Повторите эту процедуру еще два раза.

С помощью туберкулиновой шприц-системы введите мелоксикам подкожно в дозе 1 mg/kg. С помощью линейки отметьте линию коленного сустава. Сделайте две дополнительные отметки на расстоянии 2 cm и 3 cm дистальнее колена.

С помощью скальпеля сделайте циркулярный разрез кожи на три сантиметра дистальнее коленного сустава. Выполните тупую и острая диссекцию, чтобы циркулярно отделить кожу от подлежащих мышц до тех пор, пока она не будет свободно оттягиваться. Повторите процесс undermining (подсечения), проходя через более глубокие мышечные слои, чтобы провести диссекцию до кости, сохраняя при этом тканевые плоскости.

С помощью маркера отметьте большеберцовую и малоберцовую кости на один сантиметр проксимальнее циркулярного разреза. Используя маленькие костные ножницы, перережьте большеберцовую и малоберцовую кости в отмеченном месте. Используйте коагулятор для контроля кровотечения и достижения гемостаза.

Осмотрите конец кости и, при необходимости, затупите или подрежьте острые края. С помощью рассасывающейся плетеной шовной нити 4-O сблизьте передние края мышечных компартментов над большеберцовой костью и зафиксируйте их четырьмя-шестью равномерно распределенными прерывистыми швами. Сопоставьте и зашейте передний и задний мышечные компартменты вместе над костью, чтобы сформировать мышечную подушку.

Ушейте кожу латерально прерывными absorbable плетеными швами 4-O, избегая наложения швов на опорную часть культи. Нанесите кожный клей вдоль линии разреза. Выполните продольный разрез по межъягодичной складке длиной от 1,5 до двух сантиметров, примерно в пяти миллиметрах кзади от бедренной кости.

С помощью тупой диссекции отделите ягодичные и мышцы задней поверхности бедра, чтобы обнажить седалищный нерв проксимальнее места его трифуркации. Определите проксимальные двигательные ветви, включая крупную ветвь, проходящую под каудальной бедренной мышцей (CFM), и её ответвления. Приподнимите CFM пинцетом и перережьте её.

С помощью тонких микрохирургических пинцетов Dumont выполните нейрализацию ветвей к полуперепончатой мышце и двуглавой мышце бедра путем тупого расслоения. Захватите эпиневралий и рассеките его продольно, используя тонкие изогнутые пружинные ножницы. Затем разделите ветви нерва.

Сохраните ветвь m. caudofemoralis и пересеките остальные ветви рядом со стволом седалищного нерва. Отогните двигательные ветви вниз для облегчения коаптации. Используя изогнутые пружинные ножницы, вскройте эпиневрий и рассеките его, чтобы нейтрализовать трифуркацию седалищного нерва.

С помощью тонкого пинцета осторожно разделите ветви нерва. Захватите пинцетом каждую из трех ветвей — общий малоберцовый, большеберцовый и икроножный нервы — на расстоянии 5–10 мм дистальнее трифуркации. Удерживая нерв в натяжении, перережьте каждую ветвь дистально и иссеките сегмент длиной 5–10 мм.

Используйте нейлоновые нити 10-0 для выполнения коаптоза, сначала соединив общий промежностный нерв с полуперепончатой мышцей. На каждый шов накладывайте не менее трех узлов. Обеспечьте размещение без натяжения, избегая чрезмерного затягивания и образования складок на нерве, и располагайте коаптозы без резких углов.

Затем соедините большеберцовый нерв с крупной ветвью двуглавой мышцы бедра, а малоберцовый нерв — с малой ветвью двуглавой мышцы бедра. При ампутации без реиннервации целевой мышцы, после обнажения ветвей седалищного нерва, с помощью шелковой нити 5-O и пинцета перевяжите общий малоберцовый, большеберцовый и икроножный нервы, следя за тем, чтобы лигатура пережимала нерв и была закреплена четырьмя квадратными узлами. Осторожно потяните каждый нерв проксимально за узел и пересеките его на расстоянии одного-двух миллиметров дистальнее лигатуры.

Удалите 10 мм дистального сегмента нерва, затем проведите ампутацию, как было продемонстрировано ранее. После ушивания разреза нанесите кожный адгезив вдоль линии разреза. В течение семи дней ежедневно наблюдайте за крысой, проверяя целостность раны, наличие признаков инфекции, боли или дистресса, и при необходимости примите меры в соответствии с рекомендациями IACUC.

Пороги механического отвращения, измеренные с помощью теста фон Фрея, были значительно снижены по сравнению с исходным уровнем и оставались пониженными во всех временных точках после ампутации. Тестирование с помощью иглы выявило тенденцию к усилению ноцицептивных реакций с течением времени по сравнению с исходным уровнем. Холодовая гиперчувствительность культи была выраженной и сохранялась на уровне ниже исходного во всех временных точках.

Данный протокол позволяет оценивать различные стратегии манипуляций с нервами в контексте ампутации. Основной трудностью при выполнении этого протокола является атравматичное манипулирование нервами шириной менее одного миллиметра. В будущих исследованиях данную работу можно расширить для совершенствования моделей и разработки более надежных методов изучения фантомных болей в конечностях.