In vitro Дифференцировка CD8 Т-клеток с резидентной памятью с использованием системы кокультуры эпителиальной органоидно-Т-клеточной клетки

Наши исследования изучают Т-клетки памяти CD8 в женском репродуктивном тракте, изучая, как инфекции и болезни влияют на их проживание, функцию, поддержание и терапевтический потенциал. Существующие методы ограничивают выживаемость и фенотипическую стабильность резидентных Т-клеток памяти. Этот протокол позволяет проводить масштабируемое in vitro исследование, индуцируя резидентуру тканей с помощью культа органоидных Т-клеток.

Для начала используйте пластинчатые вагинальные эпителиальные органоиды (VEO) с плотностью 10 000 клеток в 20 микролитрах экстракта базальной мембраны на одну скважину пластины с 24 лунками. Поставьте тарелку в инкубатор и поддерживайте культуры в течение семи-десяти дней при 37 градусах Цельсия. За день до совместного выращивания аспирируйте клеточную культурную среду из назначенных колодцев и промыйте колодцы DPBS.

Аспирируйте DPBS, затем введите 600 микролитров предварительно подогреного ЭДТА с 0,25% трипсином в колодцу. Используя пипетку P1000 с BSA-покрытием, тщательно ресуспеншируйте, чтобы механически разрушить экстракт из базальной мембраны и переместить содержимое скважины в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров с покрытием BSA. Теперь поместите коническую трубку в водяную ванну при температуре 37 градусов Цельсия.

Через пять минут добавьте 10 миллилитров 10% FBS в RPMI, чтобы закалить трипсинизацию. Затем поместите трубку в центрифугу и вращайте при температуре 500 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, после чего сбросьте супернатант. Используя наконечник пипетки, покрытый BSA, суспензируете гранулу в 100–300 микролитрах среды для органоидной культуры Т-клеток или обычной DMEMF 12.

Считайте клетки с помощью гемоцитометра. Вычислите объём вируса, необходимый для достижения множества инфекции 0,1, используя общее количество клеток и известный вирусный титр. Аспирировать клеточную культурную среду из отобранных для инфекции колодец VEO.

Промой каждую скважину 500 микролитрами предварительно подогреного DPBS и поставь тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут. Через пять минут сбросьте DPBS. Добавьте 500 микролитров органоидной среды, содержащей достаточное количество вирусных частиц, чтобы достичь множества инфекции 0,1.

Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа на час, аккуратно помещая её вручную каждые 20–30 минут. Переведите необходимое количество экстракта базальной мембраны, необходимое для нанесения пластины, с минус 80 градусов Цельсия на четыре градуса Цельсия и дайте ей оттаять восемь часов. Проверьте VEO под световым микроскопом, чтобы оценить размер и общее состояние.

Подтвердите, что VEO имеют диаметр примерно 100 микрометров, имеют однородную круглую морфологию и минимальное количество отдельных клеток. Аспирируйте клеточную культурную среду из скважин VEO и промывайте каждую скважину 500 микролитрами холодной стерильной DPBS при температуре от двух до восьми градусов Цельсия. После удаления DPBS добавьте в каждую скважину от 200 до 500 микролитров холодного раствора для сбора органоидов, обеспечивая объём не менее 10 раз относительно капли экстракта из базальной мембраны.

Затем, используя пипетку с BSA-покрытием P200, механически нарушайте экстракт из базальной мембраны. Теперь поставьте пластину на орбитальный шейкер, установленный примерно на 100 оборотов в минуту при 4 градусах Цельсия, на 20 минут. После инкубации используйте наконечник пипетки с BSA-покрытием, чтобы смешать и переместить содержимое каждой колодцы в стерильную 15-миллилитровую коническую трубку с BSA-покрытием.

Поместите трубку в центрифугу и вращайте при 500 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия. Затем отбросьте супернатант. Промой гранул VEO с пятью-десятью миллилитрами холодного DPBS и снова центрифугуйте при 500 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия.

Аспирируйте DPBS, затем с помощью наконечника пипетки P1000, восстановите пеллет в одном миллилитре среды для Т-клетки органоидной культуры и поместите VEO-суспензию на лёд до тех пор, пока Т-клетки не будут готовы к совместной культуре. Для сбора Т-клеток проверяйте покоящие Т-клетки под световым микроскопом, чтобы оценить размер и общее состояние. Подтвердите, что Т-клетка демонстрирует некоторое скопление, увеличенную морфологию и отсутствие видимых клеточных остатков или фрагментов.

С помощью пипетки P1000 подвесьте Т-элементы, несколько раз поднимая и опуская их в каждом углу скважины. Возьмите коническую трубку и подсчитайте общее количество живых Т-клеток CD8. Далее поместите T-элемент в центрифугу и вращайтесь при 584 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия.

Отбросьте супернатант и снова суспензируйте Т-клеточную гранулу в 10 миллилитрах Т-клеточной органоидной культурной среды. Затем переместить соответствующее количество Т-клеток в коническую трубку, содержащую ранее подготовленные VEO, чтобы объединить эти клетки. Поместите объединённую VEO и T-элементарную суспензию в центрифугу и снова вращайтесь при 584 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия.

После удаления супернатанта ВЭО и Т-клетки снова суспензируются в нужном объёме экстракта базальной мембраны. Затем, используя другой наконечник пипетки, нанесите суспензию на предварительно нагретую пластину для культуры тканей, выделяя по 20 микролитров на каждую ячейку для пластины на 24 лунки. Теперь переверните пластину для культуры тканей и поместите её вверх ногами в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.

Дайте 30 минут на полное склеивание и затвердевание базальной мембраны. После инкубационного периода аккуратно добавляйте в каждую скважину полный Т-клеточный органоидный культурный материал. Раздайте 500 микролитров на скважину для пластины с 24 лунками или 250 микролитров на скважину для пластины с 96 луцами, добавляя среду к стене скважины, чтобы не нарушать каплю экстракта из базальной мембраны.

Заменяйте посевную среду каждые два дня, пока образцы не будут собраны для анализа проточной цитометрии. Семидневные мышиные ВЭО, инфицированные вирусом лимфоцитарного хориоменингита, экспрессирующими жёлтый флуоресцентный белок, демонстрировали обильную вирусную репликацию уже через четыре часа после совместной культуры, что было видно по флуоресцентным сигналам внутри органоидов. Накопление Т-клеток CD8 рядом с инфицированными органоидами стало заметным в более поздние периоды совместного выращивания.

Прогрессивная агрегация Т-клеток CD8 была связана с заметным уменьшением сигнала жёлтого флуоресцентного белка в инфицированных органоидах в более поздние временные моменты. Т-клетки CD8, культивируемые совместно с инфицированными VEO, со временем показали повышенную экспрессию CD 69 и CD 103, что указывает на приобретение фенотипа памяти, проживающего в тканях. Антиген-стимулированные CD69-положительные, CD103-положительные, CD8-Т-клетки показали значительное увеличение внутриклеточной выработки интерферона гамма- и интерлейкина 2 по сравнению с нестимулированными контролями.

Этот протокол позволяет проводить in vitro изучение Т-клеток памяти CD8, что позволяет эффективно манипулировать эпителиальными и Т-клетками без зависимости от животных моделей. Самой важной задачей в этом протоколе является поддержание здоровых, жизнеспособных Т-клеток и вагинальных эпителиальных органоидов, поскольку низкая жизнеспособность или инфекция снижают выживаемость в кокультуре и экспериментальные результаты. Мы сосредоточились на анализе потоковой цитометрии, но кокультуры можно собирать для окрашивания, визуализации и секвенирования.

Безопасный носитель позволяет использовать ELISA.