Подготовка и обработка кальцифицированных артерий с сохраненной морфологией и РНК для цифрового пространственного профилирования

Пространственная транскриптомика даёт преимущество как по сравнению с одноклеточной РНК, так и по сравнению с объёмной РНК, сохраняя пространственную информацию внутри ткани. Используя такие инструменты, как RNAscope, вычислительная деконволюция и общедоступные наборы данных о отдельных клетках, можно отобразить поведение клеток с их нишевой и генной структурой и создать интегрированный взгляд на биологию тканей. Эта технология взрывается.

Две статьи журнала Nature за май 2025 года посвящены исследованиям пространственной транскриптомики. Если посмотреть на PubMed, кривая будет ещё крутее: примерно 150 пространственных статей в 2023 году, почти 300 в 2024 году и, по мере того, чтобы превысить 500 публикаций в 2025 году. Пространственная транскриптомика уже изменила несколько крупных исследовательских направлений, таких как биология рака, нейронаука, иммунология и биология развития.

Однако сосудистая биология отстает. Гетерогенность и уникальная геометрия артерий и вен делают их сложными для прикрепления тканей и сохранения РНК. Кроме того, запущенные сосудистые поражения характеризуются кальцификацией и тромбозом, что дополнительно снижает целостность тканей.

Этот протокол специально разработан для структур, похожих на сосуды. Мы также включаем методологии для снижения стоимости и необходимых процессов окрашивания для оценки РНК, осаждения кальция и интересующих клеток. Учитывая нынешний дефицит исследований пространственной транскриптомики, ориентированной на сосудь, по сравнению с другими областями, этот протокол разработан как экономически эффективный и удобный для начинающих, предоставляя сосудистым исследователям доступные инструменты для внедрения пространственной транскриптомики в своих исследованиях.

Этот протокол также потенциально полезен для больших когортных образцов для клинических экспериментов. В этом протоколе мы описываем подробные процедуры, охватывающие тщательное обращение с кальцифицированными тканями артерий, методы кальцификации свойств, направленные на сохранение качества РНК и морфологии тканей, методы окрашивания для проверки и руководства при выборе ROI, а также окончательное окрашивание морфологических маркеров на подготовленных стеклах, чтобы обеспечить их готовность к обработке на цифровом пространственном профилере. Человеческие большеберцовые артерии, включая переднюю большеберцовую артерии, заднюю большеберцовую и промежностную артерии, были взяты из ампутационных образцов пациента и хранятся в DMEM, содержащем 1% HEPES и 1% пенстрептококк.

Каждая артерия переносится в 100-миллиметровую чашку Петри вместе с носителем. Избыточная периваскулярная соединительная ткань удаляется стерильными ножницами и щипцами, оставляя только стенку артерии. Обрезанная артерия переносится в новую чашку Петри.

Внутри блюда готовят стерильную разделочную доску. Артерии разрезаются на сегменты диаметром один сантиметр с помощью хирургического лезвия. Два сегмента каждой артерии мгновенно замораживаются в криотрубках в жидком азоте для криоконсервации и хранения для будущей работы с белками или РНК.

Оставшиеся сегменты помещаются в 15-миллилитровые трубки с 10% нейтральным буфером формалина и фиксируются при температуре четырёх градусов Цельсия на 24–48 часов. Готовится раствор декальцификации с 10% ЭДТА в растворе стабилизации РНК, с корректировкой pH до 5,2 для рабочего раствора. Фиксированные ткани переносятся в новую чашу с PBS, и ткани ненадолго промываются.

Каждый образец перемещается в 15-миллилитровую трубку с раствором декальцификации и перемешивается при 4 градусах Цельсия в течение 72 часов. После завершения декальцификации образцы промываются дважды с помощью PBS с мягким перемешиванием в течение пяти минут. Ткани перемещаются в кассеты.

Кассеты помещаются в тканевой процессор. Обработка формалина проводится не менее четырёх часов. Время может варьироваться в зависимости от матрицы выборки.

В каждом блоке размещается несколько сегментов артерии. Блок заполняется парафином и полностью остывает. Слайды готовятся путём маркировки ограниченной ткани на спинках слайда.

Убедитесь, что все сегменты находятся в ограниченной зоне, требуемой инструментом GeoMx DSP. Избыточный парафин убирается с блоков. Затем блоки разделяются на пять микрон с помощью лопастей низкого профиля.

Тканевые ленты крепятся в отмеченной области. В эксперименте с DSP, на блок устанавливается как минимум четыре последовательных секции для различных окрашиваний. Храните стекли при четырёх градусах Цельсия до использования.

Далее проводится гибридизация РНКскопа на месте, а также гистологическое окрашивание на серийно подготовленных слайдах. Кроме того, другой набор слайдов окрашен морфологическими маркерами, такими как CD45 для иммунных клеток и альфа-SMA для гладкомышечных клеток. Процедура гибридизации РНКскопа на месте кратко состоит из четырёх основных этапов: выпечка на слайдах как предварительной обработки, стандартная депарафинизация и регидратация, извлечение мишени, гибридизация зонда с усилением сигнала и окрашивание красителем для визуализации РНК.

Для гистологической валидации проводятся как окрашивание H&E, так и окрашивание Alizarin Red S для точной локализации кальциевых отложений. Наконец, окрашивание морфологических маркеров проводится по стандартному иммуногистохимическому протоколу для идентификации интересующих клеток, направляющих отбор ROI. В этом исследовании сравнивались два протокола на основе EDTA: один — 10% EDTA самостоятельно в течение 72 часов, и второй — 10% EDTA и стабилизирующий раствор РНК на одинаковый срок.

Морфология и качество РНК оценивались с помощью гибридизации на месте с помощью РНКскопа. Оба метода сохраняли архитектуру сосуда, но слайды, обработанные ЭДТА и коктейлем стабилизирующего раствора РНК, показали заметно более сильные сигналы РНК, что показано на правой панели, что указывает на то, что стабилизирующий раствор защищает транскрипты, в то время как ЭДТА хелатирует кристаллический кальцийфосфат и постепенно размягчает образец без активации РНаз. С оптимизацией стратегии сохранения РНК и подтверждением качества мы демонстрируем шаги для гистологического окрашивания для кальциевого отложения с использованием гематоксилина и эозина, а также Alizarin Red S. Ализарин избирательно связывает ионные кальциевые соли и меняет оттенок от оранжевого к кирпично-красному, что чутко подчёркивает микро- и макрокальцификации, хотя содержит меньше деталей клеточного и внеклеточного матрикса, чем H&E.

Использование обоих окрасок максимизирует структурную и композиционную информацию. После окрашивания морфологических маркеров слайды сканируются на платформе GeoMx. Антитела CD45 маркируют иммунные клетки, а альфа-гладкая мускулатура актина маркирует сосудистые гладкомышечные клетки, присутствующие в среде.

Выбранные ROI охватывают примерно 100–150 ядер с достаточным выходом РНК. ROI размещались рядом с кальцифицированными участками и вдали от них для сравнения пространственных паттернов экспрессии генов, связанных с медиальной кальцификацией большеберцовых артерий. Несмотря на некоторую потерю тканей во время многочасовых этапов обработки, в каждом артериальном срезе было выявлено несколько подходящих ROI.

В заключение, этот рабочий процесс охватывает обработку и декальцификацию тканей кальцифицированных артерий через валидационное окрашивание и выбор ROI для исследования пространственной транскриптомики. В частности, сочетание H&E с кальциеспецифическим окрашиванием ализарина обеспечивает точную локализацию сосудистой кальцификации и максимизирует структурную и составную информацию для размещения ROI. Анализ РНКскопов показывает, что декальфицированные артериальные срезы остаются в значительной степени целыми при достаточном числе РНК.