Неонатальная мышиная модель некротизирующего энтероколита и выделение собственной пластинки для профилирования иммунных клеток
19 сентября 2025 г.
В этом протоколе описана неонатальная мышиная модель некротизирующего энтероколита (НЭК) и последующее выделение собственных иммунных клеток lamina из тонкой кишки неонатальной мыши.
Наши исследования сосредоточены на заболевании, поражающем медицински уязвимых младенцев, называемого некротизирующим энтероколитом. Наша цель — выявить механизмы, участвующие в иммунном ответе при NEC, и разработать стратегии ранней диагностики и профилактики заболевания. Очень сложно изучать ответы иммунных клеток кишечника при неонатальной NEC. Наш протокол заполняет этот пробел, демонстрируя, как выделить иммунные клетки проприи пластинки для анализа с помощью проточной цитометрии.
Для начала возьмите культуру кишечных бактерий, взятых у младенца с некротизирующим энтероколитом тоталис, или NEC. В экспериментальный день 0 в 15:00 пипетка 20-микролитрового аликвота культуры в 15-миллилитровую пробирку с 2 миллилитрами бульона Лурия-Бертани. Инкубировать бактериальную культуру при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов в орбитальном шейкере с температурой 1G, обеспечивая сохранение крышки трубки в вентиляционном положении.
Одновременно инкубировать вторую культурную трубку с 2 миллилитрами бульона Лурия-Бертани в качестве контроля для проверки загрязнения. На следующий день в 7:00 утра пипетка 125 микролитров ночной бактериальной культуры в колбу для культуры клеток T75 с вентилируемой крышкой, содержащей 25 миллилитров бульона Лурия-Бертани. Подготовьте в общей сложности четыре колбы T75 и инкубуйте в вертикальном положении при 37 градусах Цельсия в течение двух часов в орбитальном шейкере, настроенном на 1G.
В 9:00 утра в экспериментальные дни 1, 2 и 3 смешайте 16 миллилитров детской смеси с 8 миллилитрами щенячьего молока в стерильной 50-миллилитровой центрифуге для приготовления смеси. Удалите супернатант из двух 50-миллилитровых центрифугных трубок с гранулированной бактериальной культурой. Тщательно суспензируйте каждую из двух гранул в 2 миллилитрах готовой смеси.
Затем переливаем обе вновь суспендированные смеси в оставшуюся смесь, чтобы получить в общей сложности 24 миллилитра NEC-смеси. Маркируйте шесть 50-миллилитровых центрифуг с шестью точками времени подачи. Пипетка насыпать 4 миллилитра формулы NEC в каждую из шести маркированных трубок.
Далее приготовьте шесть одноразовых аликвотов липополисахаридного бульона с концентрацией 5 миллиграмм на миллилитр и храните в микротрубках с низким уровнем связывания при температуре 20 градусов Цельсия. Непосредственно перед кормлением разморозите один липополисахарид аликвот и создайте вихрь на 15 секунд. Добавьте рассчитанный объём липополисахарида в 4-миллилитровую трубку формулы NEC и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
Наполните 1-миллилитровый шприц подготовленной формулой NEC и подключите её к неонатальной PICC линии. Чтобы ввести формулу NEC каждому щенку через оральный гаваж, аккуратно удержите его за отвисшую кожу у основания шеи и держите его вертикально. Расстояние введения линии PICC равно расстоянию от уголка рта до верхней части молочного пятна в желудке.
Оптимальная точка вставки на линии PICC должна быть отмечена перманентным маркером. С помощью щипцев направляйте линию PICC в ротоглотку и вниз в желудок. Если возникает сопротивление, удалите линию PICC, перестановите её и попробуйте вставить её обратно.
Медленно вводите 80 микролитров смеси NEC в желудок. Следите за собакой на предмет аспирации во время кормления. После кормления удалите линию PICC и наблюдайте за затруднённым дыханием или рвотой.
Если происходит рвота, промокните рот и нос щенка лабораторной салфеткой с низким содержанием ворса. Повторяйте процесс кормления во всех точках кормления. На 4-й экспериментальный день получите кишечную ткань у усыпленных мышей новорождённых.
Ножницами разрежьте кишечник продольно, чтобы открыть его, затем разделите поперечно на сегменты диаметром 1–1,5 сантиметра. Переместите кишечные сегменты в 15-миллилитровую центрифугную трубку с 10 миллилитрами предварительного переварительного раствора, охлаждённого на льду. Затем инкубировать трубку при 37 градусах Цельсия с непрерывным вращением в течение 20 минут, чтобы начать расщепление тканей.
Аккуратно покрутите трубку, чтобы освободить рассыпанную ткань, затем пролейте содержимое через 100-микрометровое сито для клеток, установленное поверх 50-миллилитровой центрифугной трубки. Перенесите оставшиеся фрагменты ткани в новую 15-миллилитровую центрифугную трубку с 10 миллилитрами раствора для пищеварения, предварительно нагретой до 37 градусов Цельсия. Инкубировать образец с непрерывным вращением в течение 40 минут при 37 градусах Цельсия.
Затем переместить содержимое в автоматическую трубку для диссоциации тканей. Запускайте программу с четырьмя циклами вращения по 15 секунд, чередующихся по часовой и против. Когда диссоциация завершена, аккуратно вихрьте суспензию клетки в диссоциационной трубке, а затем центрифугуйте её при 300G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
Аккуратно вдыхайте супернатант, не нарушая гранулу. Суспензировать клетки в 1 миллилитре буфера сортировки клеток, активируемого флуоресценцией. Поставьте 100-микрометровый фильтр на 50-миллилитровую трубку центрифуга.
Переведите вновь взвешенные клетки через сито и промыйте их 2 миллилитрами буфера для сортировки клеток, активируемых холодной флуоресценцией. Подсчитайте изолированные клетки и оцените жизнеспособность с помощью трипан-синего или красителя для жизнеспособности. Центрифугуйте нужный объём для цитометрии потока при 300G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
В группе лечения NEC наблюдалось значительное снижение выживаемости по сравнению с контрольными группами, питаемыми DAM. Общий кишечный анализ мышей NEC выявил характерные признаки NEC, включая видимые признаки вздутия, накопления воздуха и пневматоз внутреннего кишечника по сравнению со здоровыми контролями. Окрашивание гематоксилином и эозином выявило пятнистое разрушение ворсунка и нарушение структуры кишечника у мышей с NEC по сравнению с целыми ворсинками в контроле.
Экспрессия мессенджерной РНК IL1B, CXCL2 и LCN2 была значительно выше в группе NEC, чем в контрольных группах. Общее количество иммунных клеток CD45+ в кишечной пластинке propria не отличалось существенно между группами NEC и контрольной группой. Уровни макрофагов в кишечнике NEC были значительно повышены по сравнению с контрольными группами.
Мыши NEC показали повышенную долю миелоидных клеток, особенно моноцитов и макрофагов, по сравнению с другими подтипами иммунитета. Одноклеточные мультиомические подходы открывают иммунные клеточные сигнатуры в NEC, открывая новые знания о механизмах и потенциальных биомаркерах. Моделирование NEC сложно, потому что заболевание многофакторное.
Воспроизведение человеческой кишечной среды, иммунных ответов и микробных влияний у неонатальных мышей требует тщательной оптимизации. Наша модель интегрирует микробиом, гипоксию и кормление смесями, полученные от человека, что делает её физиологически значимой для детального профилирования иммунных клеток у новорождённых мышей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол индукции некротизирующего энтероколита (НЭК) у новорожденных мышей — модели, которая точно имитирует течение данного заболевания у недоношенных младенцев. Протокол сочетает в себе кормление смесью, интермиттирующую гипоксию, пероральное введение липополисахарида (LPS) и кишечных бактерий, полученных от младенца с НЭК, для надежного воспроизведения основных патологических и иммунологических признаков НЭК. Кроме того, в статье описаны методы выделения иммунных клеток из собственной пластинки слизистой оболочки тонкого кишечника, что позволяет проводить комплексное иммунное профилирование с помощью проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Неонатальная гастроэнтерология
- Иммунология
- Экспериментальное моделирование заболеваний
Теоретическая база
- Некротизирующий энтероколит (НЭК) представляет собой опасное для жизни воспалительное заболевание, поражающее кишечник недоношенных младенцев.
- НЭК характеризуется повреждением эпителия, микробным дисбиозом и нарушением иммунного ответа.
- Животные модели имеют важное значение для понимания патогенеза НЭК и разработки методов лечения.
- Мышиные модели, воспроизводящие признаки человеческого НЭК, значительно способствовали развитию данной области.
Цель исследования
- Создать воспроизводимую модель НЭК у новорожденных мышей, отражающую характеристики заболевания у людей.
- Обеспечить возможность изучения иммунных ответов при НЭК путем выделения клеток собственной пластинки слизистой оболочки.
- Обеспечить возможность детального профилирования иммунных клеток с помощью проточной цитометрии.
Используемые методы
- Индукция НЭК у новорожденных мышей путем кормления смесью, интермиттирующей гипоксией, перорального введения LPS и энтерических бактерий пациента с НЭК.
- Гистологическая оценка повреждения кишечника.
- Выделение иммунных клеток из собственной пластинки слизистой оболочки тонкого кишечника.
- Проточная цитометрическая анализ популяций клеток врожденного и адаптивного иммунитета.
Основные результаты
- Протокол надежно вызывает гистологические, транскрипционные и иммунологические признаки, соответствующие человеческому NEC.
- Позволяет проводить детальное профилирование популяций иммунных клеток кишечника.
- Поддерживает исследования как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа при NEC.
- Способствовал ряду ключевых открытий в исследованиях NEC.
Выводы
- Эта модель новорожденных мышей является надежным инструментом для изучения патогенеза НЭК и иммунных ответов.
- Данный протокол поддерживает трансляционные исследования, направленные на разработку новых методов терапии НЭК.
- Изоляция и профилирование иммунных клеток имеют решающее значение для понимания механизмов заболевания.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Надежные доклинические модели имеют важное значение для снижения рисков при проверке терапевтических гипотез на ранних стадиях при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как некротизирующий энтероколит (NEC). Данная модель на новорожденных мышах в сочетании с профилированием иммунных клеток собственной пластинки слизистой оболочки позволяет детально изучить механизмы путей развития заболевания и иммунных ответов, имеющих значение для NEC у людей. Этот подход обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней и служит основой для принятия решений о трансляционном внедрении иммуномодулирующих стратегий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет снизить механистические риски при изучении иммунных путей, вовлеченных в патогенез NEC.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем воспроизведения признаков заболевания человека in vivo.
- Способствует проверке гипотез относительно повреждения эпителия и иммунной дисрегуляции.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему, релевантную заболеванию, для оценки иммуномодулирующих соединений.
- Позволяет проводить количественное профилирование иммунных клеток с помощью проточной цитометрии для получения воспроизводимых результатов.
- Обеспечивает стандартизацию анализа и сопоставимость данных между исследованиями в рамках доклинических рабочих процессов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает согласованность доклинического иммунного профилирования со стратегиями трансляционных биомаркеров при NEC.
- Обеспечивает преемственность от выявления механизмов до доклинической валидации терапевтических кандидатов.
- Поддерживает продвижение иммунологических мишеней для лечения кишечных заболеваний новорожденных с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель позволяет исследовать иммунные пути на стыке этапов первичного поиска и доклинической валидации, что способствует идентификации перспективных соединений-лидеров и развитию трансляционных исследований НЭК.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез и снижение биологических рисков при изучении иммунных механизмов НЭК.
- Скрининг: обеспечивает количественные и воспроизводимые показатели иммунных клеток для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить проточный цитометрический анализ популяций врожденного и адаптивного иммунитета для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: связывает результаты изучения механизмов с доклиническими конечными точками, согласованными с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многократно используемую платформу для иммунного профилирования в рамках различных программ НИОКР, сосредоточенных на НЭК.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации иммунных мишеней и обеспечивает ясность механизмов действия.
- Операционная ценность: Стандартизирует выделение и профилирование иммунных клеток для создания воспроизводимых и масштабируемых рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях NEC.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию иммунологических мишеней и терапевтических кандидатов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с новорожденными мышами и владение методами выделения иммунных клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и соответствующей аналитической инфраструктуре.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов выделения и профилирования клеток.
- Может потребоваться адаптация метода для других моделей заболеваний или возрастных групп.
- Практические ограничения включают сложность модели и техническую вариабельность процедур с новорожденными животными.
