Визуализация эндоцитарного транспорта в живых клетках с использованием функционализированных нанотел в культивируемых клетках

Мы изучаем эндоцитарный и ретроградный трафик трансмембранных белков, а также механизмы, обеспечивающие транспорт. Для изучения белкового трафика с поверхности клетки обычно используют традиционные антитела, но они могут способствовать перекрёстному сшиванию и лизосомному таргетингу. Для начала получите гранулу бактерий Escherichia coli, трансформированную с помощью VHH-mCherry.

Добавьте 30 миллилитров ледяного буфера связывания, содержащего 20 миллимолярного имидазола в PBS, в бактериальную клеточную гранулу. С помощью пипетки тщательно подвесите гранулу, прокручивая вверх и вниз. Переложите восстановленную смесь в маркированную 50-миллилитровую центрифугную трубку.

Добавьте восстановленные клетки 200 микрограммами на миллилитр лизозима, 20 микрограммами на миллилитр ДНКазой I, одним миллимолярным хлоридом магния и одним миллимолярным фенилметилсульфонилфторидом. После инкубации трубки при комнатной температуре в течение 10 минут поместите её на вращательный конец и продолжите инкубацию при 4 градусах Цельсия в течение одного часа. Далее вставьте шестимиллиметровый твёрдый наконечник соникатора прямо в подвеску элемента.

Механически нарушайте работу бактериальных клеток с помощью трёх минутных звуковых импульсов с амплитудой 40% и циклом работы в одну секунду включения и одну секунду выключения. При этом между импульсами оставался минутный интервал охлаждения. После центрифугирования оставьте очищенный лизат на льду, готовясь к хроматографии с аффинитетом иммобилизованных металлов с использованием заранее упакованных, одноразовых колонок для очистки меток, предназначенных для работы с гравитационным потоком.

Закрепите колонки из никелево-нитрилотриоуксусной кислоты на металлической подставке или соответствующей стойке. Затем полностью спустите буфер хранения из колонны. Уравновесить колонку, добавив 10 миллилитров буфера связывания, содержащего 20 миллимолярных имидазолов в PBS.

Пусть буфер пройдет под действием силы тяжести. Постепенно наносите примерно 30 миллилитров очищенного бактериального лизата на уравновешенную колонку. Позвольте ему пройти под действием гравитации и отбросьте поток сквозь.

Затем промыйте колонку, нанеся два последовательных объёма буфера связывания по 10 миллилитров, содержащего 20 миллимолярного имидазола в PBS. Элюируйте связанные нанотела, введя два миллилитра буфера элюции с 500 миллимолярным имидазолом в PBS в двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку. Уравновесьте колонку для обезсоления, засеянную в адаптере для трубки объемом 50 миллилитров, промывая пять раз пятью миллилитрами PBS.

Пусть буфер полностью войдёт в упакованную смолу, затем отбрось поток сквозь неё. После финального промывания центрифугуйте колонку при 1000 x g в течение двух минут. Теперь переместите колонку с адаптером на новую 50-миллилитровую трубку после отброса потока.

Загрузите два миллилитра элюированного функционализированного наноне на заранее уравновешенную колонку обезсолённой системы. Затем снова центрифугуйте при 1000 x g в течение двух минут, чтобы собрать элуат перед проверкой экспрессии и чистоты VHH-mCherry. Запустите программное обеспечение автоматизированной системы живой ячеточной визуализации.

Перенесите камеру микроскопии ибиди на стадию микроскопа. Настройте два канала визуализации с использованием фильтров возбуждения и излучения для EGFP и mCherry. Выбирайте короткое время экспозиции и низкую интенсивность освещения, чтобы избежать отбеливания фотографий.

Держите настройки постоянными для всех экспериментов. Обстановка может отличаться у разных репортёров. Для каждого условия сохраняйте координаты 10 различных полей обзора, содержащих от трёх до четырёх ячеек в фокусе в точечном списке.

Затем сделайте по одному снимку каждой позиции в списке точек, чтобы использовать его в качестве эталонного изображения перед добавлением VHH-mCherry. Для начала эндоцитоза аккуратно добавьте в каждую скважину 350 микролитров предварительно нагретого раствора VHH-mCherry, минимизируя нарушения монослоя. Затем приступайте к получению изображений.

Выполните таймлапс-сбор в течение 100 кадров с интервалом 32 секунды при сохранении 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Для анализа эндоцитарного поглощения VHH-mCherry загрузите наборы таймлапс-изображений в программное обеспечение для анализа изображений. Применяйте инструменты сегментации и отслеживания для количественной оценки внутренней флуоресценции со временем в различных областях интереса.

Все функционализированные варианты Nanobody были очищены до высокой урожайности и чистоты, при этом только VHH-mCherry демонстрировал незначительное протеолитическое разрушение. Продукты деградации VHH-mCherry были подтверждены как отдельные домены VHH-mCherry с помощью эпитопно-специфического иммуноблота. При отсутствии BirA VHH-mCherry был извлечен примерно в 20 миллиграммах на препарат.

Биотинилирование было подтверждено с помощью стрептавидина агарозы смесей BSA с наноуном. Белоки слияния, отмеченные EGFP, экспрессированные в клетках HeLa, демонстрировали субклеточные локализации, соответствующие их эндогенным аналогам, включая перинуклеарную локализацию EGFP-CDMPR и EGFP-CIMPR. Эксклюзивная периядерная локализация EGFP-TGN46 и периферийная локализация TfR-EGFP.

VHH-mCherry позволил визуализировать эндоцитарный транспорт EGFP-CDMPR живыми клетками, показывая увеличение колокализации в течение 60 минут. Поглощение VHH-mCherry в экспрессирующие клетки EGFP-CDMPR достигло плато примерно через 43 минуты, с периодом полураспада девять минут. В клетках, экспрессирующих TfR-EGFP, VHH-mCherry быстро накапливался межклеточно, с периодом полураспада четыре минуты и насыщением через 20 минут.

Мы разработали универсальный набор инструментов на основе нанотел для анализа транспорта любого трансмембранного белка с поверхности клетки. Мы используем флуоресцентные нанотела для маркировки поверхностных грузовых белков, а затем изучаем их эндоцитарный трафик с помощью микроскопии живых клеток. С помощью нашего подхода к живой клеточной визуализации на основе нанотел мы хотим раскрыть пути, обеспечивающие транспортировку грузов с поверхности на транс-сеть Гольджи.